• Uwaga! Uprawa konopi w Polsce i w większości krajów jest nielegalna lub wymaga specjalnych zezwoleń. Przed wykorzystaniem informacji zawartych na tym forum lub w innych naszych serwisach upewnij się jakie przepisy regulują uprawę w Twoim kraju.
  • Chcesz pomóc w rozwijaniu forum? Zamieść link do Forum.Haszysz.com na swojej stronie lub blogu

Kultury in vitro

sub

Guest
Chwilowo bez obrazków - do uzupełnienia : brak formatowania etc. Niezły tekst choć stary bardzo - obrazki wkrótce - niekoniecznie w tekście.


KULTURY IN VITRO

Określenie „kultura in vitro" odnosi się do hodowli komórek, tkanek lub fragmentów różnych organów w naczyniach szklanych, na sztucznie sporządzonych pożywkach, przy zachowaniu ściśle kontrolowanych, sterylnych warunków. Metoda ta znalazła zastosowanie w badaniach podstawowych, a także okazała się przydatna w ogrodnictwie, rolnictwie i w innych naukach stosowanych.

Badania teoretyczne oparte na kulturach in vitro prowadzą do poznania takich zagadnień, jak: totipotencja, tj. zdolność odtwarzania całej rośliny z pojedynczych komórek, procesu różnicowania i metabolizmu komórek i tkanek oraz wpływu czynników mutagennych na komórki roślinne. Metoda ta umożliwiła także poznanie wielu zagadnień opracowywanych w biologii eksperymentalnej* W praktyce kultury in vitro znalazły szerokie zastosowanie. Dzięki tej metodzie można:


  • - szybko rozmnożyć wybrane, cenne rośliny mateczne lub gatunki wymierające,
  • - uzyskać rośliny wolne od patogenów,
  • - przyspieszyć i ułatwić prace hodowlane - przez wykrycie i rozmnożenie roślin o dużej różnorodności genetycznej wyrosłych ze zmutowanej tkanki kalusa, a także przez otrzymanie osobników homozygotycznych uzyskanych z ziaren pyłku lub komórek woreczka zalążkowego,
  • - przechowywać tkanki roślinne przez długi okres


Materiał roślinny do kultur in vitro należy pobierać z roślin znajdujących się w pełni wegetacji. Większą zdolność do regeneracji wykazują także eksplantaty pobierane z młodszych partii rośliny, np. z zarodni; pobierane z dojrzałych nasion tworzą tylko kalus i korzenie, a pobierane w 14-18 dni po zapyleniu dają kalus zdolny do organogenezy.

Termin pobierania eksplantatów jest szczególnie ważny u roślin, które zapadają w stan spoczynku. Tkanki pobrane w tym okresie wymagają traktowania substancjami wzrostowymi lub powinny być wypłukane w celu usunięcia inhibitorów. Cebule roślin ozdobnych lub ich fragmenty stosowane do hodowli in vitro łatwiej jest zmusić do regeneracji pod koniec fazy chłodzenia, niż na początku tego okresu.

Rozmnażanie w kulturach in vitro

Wiele cennych gatunków i odmian roślin ozdobnych rozmnaża się wyłącznie wegetatywnie9 gdyż osobniki uzyskane z nasion nie powtarzają cech rośliny matecznej. Jednakże przy stosowaniu tradycyjnych metod wegetatywnego rozmnażania uzyskuje się ograniczoną liczbę roślin potomnych. Dlatego też możliwość masowego mnożenia roślin w kulturach in vitro stwarza nowe perspektywy dla produkcji ogrodniczej. W kulturach in vitro mogą rosnąć i rozwijać się komórki, tkanki lub fragmenty organów roślinnych. Pierwszym widocznym objawem regeneracji jest zazwyczaj powstawanie kalusa. W zależności od składu zastosowanej pożywki, kalus można intensywnie mnożyć lub można wywołać organogenezę, tj. powstanie pąków przybyszowych, które wyrastając dają normalne rośliny. Obecnie w warunkach in vitro rozmnaża się 230 gatunków roślin ozdobnych, w tym około 100 gatunków storczyków.

Zastosowanie kultur tkankowych w produkcji ogrodniczej doprowadziło do osiągnięcia mniej lub więcej wysokiego współczynnika rozmnażania wielu roślin. U goździków np. z jednego merystemu można w wyniku hodowli in vitro otrzymać aż 10 min roślin. Z 1 merystemu hortensji po 3 miesiącach uzyskuje się od 100 do 150 roślin. Aby zwiększyć współczynnik rozmnażania należy zastosować wielokrotne dzielenie i przeszczepianie pędów lub tkanki kalusa w tzw. subkulturach. Przy długotrwałej hodowli kalusa i dużym tempie wzrostu może jednak wystąpić niekorzystne zjawisko polegające na zmianie liczby chromosomów w poszczególnych komórkach. Jeżeli z komórki, która uległa mutacji, w wyniku organogenezy powstanie pęd, wyrosła z niego roślina różni się zazwyczaj od rośliny wyjściowej, przy czym zmiany mogą być pozytywne lub negatywne.

Aby uniknąć masowego namnażania kalusa, a jednocześnie zwiększyć liczbę otrzymywanych roślin w kulturach in vitro stosuje się różne sposoby mnożenia. Jednym z nich jest podział na części pędu otrzymanego bezpośrednio z izolowanego stożka wzrostu bez przejścia fazy kalusowej. Pęd dzieli się na części (sadzonki), każda obejmująca jedno międzywęźle i dalej prowadzi na pożywkach. Po kilku tygodniach ze stożka wzrostu znajdującego się w kącie liścia powstaje pęd przybyszowy, który można dalej dzielić lub przenosząc na odpowiednie pożywki wywołać inicjację korzeni. Metoda ta, zwana mikrorozmnażaniem, znalazła zastosowanie przy rozmnażaniu złocieni i goździków.

Inną metodą masowego rozmnażania roślin w kulturach in vitro jest indukowanie pędów bocznych u izolowanego stożka wzrostu. Na odpowiedniej pożywce ( np. Murashige'a i Skooga) z dużą ilością cytokininy u podstawy izolowanego wierzchołka wzrostu powstają po pewnym czasie zespoły pędów, zwane wieloroślinkami. Każdy oddzielony pęd w zależności od sposobu dalszego prowadzenia może posłużyć do otrzymania nowych wieloroślinek lub do uzyskania normalnej sadzonki, Ten sposób rozmnażania stosowany jest w przypadku goździków, złocieni i gerber.

Do roślin masowo rozmnażanych w kulturach in vitro należą obecnie storczyki. Odmiany ogrodowe storczyków są przeważnie heterozygotami, dlatego też potomstwo uzyskane z nasion jest bardzo różnorodne pod względem genotypowym nie mówiąc o tym, iż metoda generatywnego rozmnażania storczyków jest trudna i długotrwała. Spośród otrzymanych siewek wyselekcjonowanie osobników, które wyróżniają się zdrowotnością, jakością i wielkością plonu trwa 6-10 lat. U cymbidium np. z 1000 siewek wybrać można w tym czasie zaledwie 1-3 wartościowe rośliny.

Również współczynnik rozmnażania wegetatywnego storczyków w tradycyjnej uprawie jest mały. Z 1 rośliny cymbidium po 3 latach uprawy uzyskuje się zaledwie 4-6 roślin potomnych. Natomiast dzięki zastosowaniu kultur tkankowych w ciągu 1 roku z 1 merystemu cymbidium można wyprodukować co najmniej 1 milion roślin (teoretycznie nawet około 4 min), a z 1 merystemu katleji można uzyskać przeciętnie 25-100 roślin, maksymalnie 3000. Metoda merystematycznych kultur storczyków nie tylko znacznie przyspieszyła i usprawniła dotychczasową-produkcję tych roślin, ale otworzyła także nowe możliwości przeprowadzenia badań w zakresie morfologii, fizjologii i genetyki tej grupy roślin. Należy dodać, iż meryklony, tj. rośliny uzyskane na drodze rozmnażania z tkanek w kulturach in vitro kwitną znacznie szybciej niż otrzymane z nasion.

Meryklony cymbidium zakwitają po 4-6 latach, podczas gdy osobniki otrzymane z siewu dopiero po 6-10 latach. Meryklony dendrobium kwitną natomiast już po 2 latach od chwili wyizolowania merystemu.

Prowadzenie kultur tkankowych w celu rozmnażania klonalnego roślin przebiega w kilku etapach.

I etap obejmuje okres początkowy. W ciągu 10-14 dni po szczepieniu ujawniają się ewentualne porażenia. Zainfekowane kultury należy odrzucić. W warunkach sprzyjających (odpowiednia pożywka, żywotny eksplantat) po 3-4 tygodniach stają się widoczne objawy wzrostu, pojawia się grudka kalusa, protokormu (u storczyków), cebulki, zarodek lub stożek wzrostu. Po osiągnięciu odpowiedniej fazy rozwoju, tj. po 6-8 tygodniach, eksplantat przenosi się na świeżą pożywkę ( czynność tę nazywa się pasażowaniem).

-etap polega na namnażaniu tkanek lub pędów. Z chwilą gdy kultura obejmuje całą przestrzeń w naczyniu, dzieli się tkanki lub oddziela pędy i przenosi na nowe pożywki. Czynność tę powtarza się dotąd, dopóki nie osiągnie się planowanej liczby egzemplarzy (subkultury). Protokormy storczyków namnaża się w pożywkach płynnych, umieszczając naczynia szklane na różnego typu rotorach.

-etap obejmuje indukowanie organogenezy w kalusie i w proto"kormach, ukorzenianie pędów lub występowanie okresu spoczynku organów przetrwalnikowych, np. u cebul roślin ozdobnych.

-etap dotyczy przygotowania otrzymanych roślin lub gotowych organów do życia in vivo. Na wstępie kultury przenosi się do szklarni, aby rośliny przystosowały się do nowych warunków. Niekiedy rośliny wysadza się do wyjałowionego podłoża stałego, dalej jednak zachowując warunki in vitro. Na kilka dni przed wyjęciem z naczyń szklanych otwiera się korki lub wieczka słoików w celu zahartowania roślin.

Uwalnianie roślin od patogenów

Przy masowej produkcji roślin ozdobnych istnieje niebezpieczeństwo epidemicznego rozszerzania się chorób. 0 ile pasożyty grzybowe można stosunkowo łatwo zwalczyć fungicydami, to bakteriozy i wirozy są trudne do opanowania. W walce z tymi patogenami oprócz przestrzegania ścisłej higieny oraz właściwych zabiegów pielęgnacyjnych istotnym elementem jest posługiwanie się zdrowymi roślinami matecznymi i sadzonkami.

Przy uwalnianiu roślin od wirusów lub .bakterii okazało się, że najmłodsze tkanki roślinne, tj. merystemy, są z reguły wolne od patogenów i te właśnie części roślin pobiera się do kultur in vitro Powinno się izolować jak najmniejsze merystemy, gdyż pomimo słabej żywotności tylko z nich otrzymane rośliny są zdrowe i wolne od wirusów i bakterii.

Efekt odwirusowania roślin można zwiększyć stosując zabieg, zwany termoterapią. Polega on na traktowaniu roślin matecznych przez kilka tygodni temperaturą w granicach 35-39 C. W tak wysokiej temperaturze stożki wzrostu roślin rosną szybciej aniżeli trwa wzrost i rozwój patogenów, które nie nadążają zasiedlać powstającej tkanki. Pobierając merystetay z roślin matecznych poddanych działaniu wysokiej temperatury istnieje duże prawdopodobieństwo otrzymania zdrowych roślin.

Dla roślin wrażliwych zabieg termoterapii można zmodyfikować stosując przez kilka tygodni tempera tiary zmienne. Po okresie temperatur wysokich, np. 40°C, stosowanych przez 4 godziny rośliny poddaje się działaniu temperatury 16-20°C przez 20 godzin.

Teraoterapia może być stosowana także dla sadzonek, nasion, cebul, bulw itp. Organy te przed pobraniem merystemów lub wierzchołków wzrostu (wierzchołek wzrostu zawiera merystem wierzchołkowy i 2-3 zawiązki liści) zanurza się w wodzie o temperaturze 35-54°C na kilka minut lub godzin. Takie organy przetrwalnikowe, jak bulwy, cebule i inne poddawane są termoterapii po zakończeniu wzrostu, organy zielne natomiast muszą być przed tym zabiegiem zahartowane, co polega na ograniczeniu podlewania i zaprzestaniu nawożenia.

Przed użyciem do dalszego rozmnażania roślin otrzymanych w warunkach in vitro wykonuje się testy na obecność patogenów. W celu wykrycia wirusów stosuje się test biologiczny i test serologiczny. Test biologiczny polega na zakażeniu rośliny wskaźnikowej ( różne dla różnych gatunków roślin użytkowych) sokiem rośliny, która poddana była zabiegowi odwirusowania. Brak objawów chorobowych wirozy na liściach rośliny wskaźnikowej świadczy o udanym zabiegu.

Test serologiczny, w obecności. odpowiedniego antyserum, pozwala wykryć różne wirusy. Rośliny wolne od wirusów nie są na nie uodpornione, dlatego też dalsze zabiegi uprawowe powinny zmierzać do ochrony zdrowych roślin przed ponowną infekcją. Metoda odwirusowania roślin stosowana jest najczęściej dla goździków, złocieni, frezji, mieczyków, hortensji, begonii, pelargonii, lilii, kosaćców i storczyków.

Zastosowanie kultur in vitro w hodowli twórczej

Klonowanie (rozmnażanie wegetatywne) komórek, tkanek lub organów w kulturach in vitro daje pewien procent samorzutnie powstających mutacji na skutek zmian informacji genetycznej. Liczba odchyleń może wynosić 1-5096, Mutacja występująca w tkance stałej u roślin uprawianych in vivo - pozostaje na ogół nie zauważona, jeżeli Jednak ze zmutowanej komórki stałej w kulturze in vitro powstanie merystem wtórny, który ulegnie organogenezie, to z powstającego pędu może wyrosnnć roślina o zmienionych cechach.

Innym zagadnieniem jest klonowanie roślin będących chimerami lub roślin z dziedzicznie zróżnicowanymi warstwami tkanek. Przez rozdzielenie i kulturę in vitro zróżnicowanych warstw komórek, można uzyskać rośliny o nowych cechach. Zjawisko to zostało wykorzystane w pracach nad poinsecją.

W hodowli roślin ozdobnych dużą wartość mają mieszańce hetero- zyjne. Do prowadzenia tej hodowli niezbędne Jest posiadanie różniących się, lecz spokrewnionych ze sobą, możliwie czystych, homozygotycznych linii hodowlanych. Ponieważ wiele cennych, produkcyjnych odmian roślin ozdobnych jest heterozygotami, zagadnienie hodowli mieszańcowej napotyka na duże trudności. W tym układzie więc możliwość otrzymania roślin haploidalnych w kulturach in vitro jest sprawą bardzo cenną. Rośliny haploidalne uzyskać można in vitro w wyniku organogenezy w tkance kalusowej powstałej z ziaren pyłku lub haploidalnych komórek woreczka zalążkowego. Haploidalne rośliny są Jednak bardzo wrażliwe, podatne na choroby i słabo rosną. Przy użyciu kolchicyny można podwoić liczbę chromosomów uzyskując diploida o cechach horaozygoty. Prace tego rodzaju prowadzone są na gerberach.

Przy długo trwającej kulturze in vitro haploidalnego kalusa często obserwuje się występowanie mutacji spontanicznych. Spotyka się także samoistną zmianę tkanki haploidalnej w diploidalną.


Przechowywanie tkanek w kulturach in vitro

Udane próby przechowywania kultur tkankowych przeprowadzono z trawami i złocieniami. Tkanki złocieni zamknięte w żelatynowych kapsułkach i umieszczone w temperaturze 2-3 C przy wilgotności względnej powietrza 90% i oświetleniu 10-20 lx przetrwały 6 lat. Metoda ta ma przed sobą duże perspektywy. Dzięki takiemu „bankowi" tkanek można usprawnić rozmnażanie cennych roślin ozdobnych.


Wyposażenie laboratorium do kultur in vitro

Untitled-1.jpg


Do prowadzenia laboratorium niezbędne są następujące urządzenia, aparatura, sprzęty i narzędzia:

  • prąd elektryczny - 220 V i 360 V,
  • woda ciepła i zimna,
  • gaz i palniki,
  • meble: stoły (w tym 1 laboratoryjny), szafy, szafki, stelaże z półkami,
  • stół z laminarnym przepływem sterylnego powietrza (rys. 25),
  • komora klimatyzacyjna,
  • autoklaw,
  • wytrząsarka, mieszadło elektromagnetyczne lub rotor (rys. 26) do utrzymywania w ruchu probówek z pożywką płynną,
  • lodówka z zamrażalnikiem,
  • destylarka,
  • bidestylarka (najlepiej szklana),
  • suszarka,
  • mikroskop stereoskopowy,
  • waga techniczna,
  • waga laboratoryjna,
  • piecyk do sterylizacji narzędzi,
  • zmywarka do naczyń lub myjnia laboratoryjna,
  • łaźnia wodna,
  • pehametr,
  • szkło laboratoryjne: zlewki o różnej pojemności, kolby 2-5 1 oraz kolby 50-250 ml,
  • probówki (rys. 27),
  • butelki, słoiki, cylindry miarowe, płytki Petriego,
  • pojemniki na wodę destylowaną,
  • narzędzia: pipety, skalpele, pensety, nożyczki, porcelanowa łyżka do nabierania odczynników, ezy, folia aluminiowa, wata, lignina, gaza, cienki sznurek, środki myjące, miski, wiadra, szczotki do mycia probówek, koszyczki metalowe do suszenia korków, koszyczki do probówek, szczelny pojemnik metalowy - do przechowywania wysterylizowanych narzędzi, waty, ligniny oraz masek chirurgicznych służących do zasłonięcia ust i nosa podczas szczepień.


Laboratorium zajmuje zazwyczaj "kilka pokoi. Główne pomieszczenie stanowi pożywkarnia, gdzie sporządza się pożywki, przysposabia naczynia do kultur oraz przygotowuje materiał roślinny do szczepień.

W pożywkami powinien znajdować się stół, najlepiej laboratoryjny, do którego podłączony zostanie gaz i woda. Na stole tym można zmontować urządzenie szklane do otrzymywania wody bidestylowanej, którą używa się do sporządzania pożywek* Następnie niezbędne są szafy i szafki z półkami na szkło laboratoryjne 1 inne drobne przedmioty, szafy na odczynniki chemiczne oraz lodówka, w której przechowuje się substancje wzrostowe oraz stężone roztwory pożywek.

W pożywkami powinno znaleźć się również miejsce na mały stolik, przy którym można byłoby sporządzać korki do zatykania probówek lub innych naczyń. Korki mogą być wykonane z waty lub ligniny obciągniętej gazą oraz z pianki poliuretanowej. Jako korki można używać również kapsli termoodpornych, korków z plastyku lub korków gumowych z odpowietrznikami, tj. małymi otworkami w środku korka zatkanymi watą.

W pobliżu pożywkami należy urządzić pokój wagowy. Pomieszczenie to nie może być narażone na przeciągi i wstrząsy, a więc najlepszy byłby pokój nieprzechodni. Wagi powinny być ustawione na mocnym, stabilnym stole wagowym lub na specjalnie wzmocnionych i wypoziomowanych płytach przytwierdzonych do ścian bocznych. W pomieszczeniu tym może również znajdować się pH-metr służący do ustalania odczynu sporządzanych pożywek.

Myjnia, jak sama nazwa wskazuje, służy do mycia szkła. W wyposażeniu myjni powinien znaleźć się podwójny zlew kamionkowy, półki do naczyń, suszarka do naczyń, szafki do magazynowania środków myjących oraz do kwasu siarkowego potrzebnego do sporządzania chromianki, kubły i miski. W nowocześnie wyposażonej myjni do mycia naczyń stosuje się domową zmywarkę zaadaptowaną do mycia szkła laboratoryjnego lub myjnie laboratoryjne, które można odpowiednio zaprogramować. W myjni może być umieszczony autoklaw, o ile nie ma dodatkowego pomieszczenia na to urządzenie, a także w pobliżu dopływu prądu i wody powinna znaleźć się destylarka, gdyż woda destylowana potrzebna jest do płukania naczyń, narzędzi i korków gumowych lub z tworzyw sztucznych.

Następnym, ważnym pomieszczeniem w laboratorium kultur in vitro jest pokój ( kamera) do szczepień zaopatrzony w wentylator i gaśnice. Pokój ten powinien być chociaż do połowy wysokości wykładany płytkami ceramicznymi, gdyż ułatwia to utrzymanie czystości łącznie z myciem ścian przed każdym szczepieniem. Szczepienie można wykonywać przy zwykłym stole lub przy stole z laminarnym przepływem powietrza. Do pomieszczenia tego należy przeprowadzić światło, wodę i gaz. Woda potrzebna jest do zamontowania umywalkisłużącej do mycia rąk przed szczepieniem, gaz natomiast umożliwia stosowanie palnika do opalania wlotów naczyń szklanych przed założeniem korków oraz do opalania narzędzi przy szczepieniu ( o ile nie ma w laboratorium specjalnego piecyka do dezynfekcji). Do tego celu można również użyó lampkę spirytusową, W pokoju do szczepień powinna znaleźć się przynajmniej Jedna lampa bakteriobójcza UV zawieszona u sufitu. Stół z laminarnym przepływem sterylnego powietrza produkowany w Zakładach „Polon" w Poznaniu działa na zasadzie oczyszczania powietrza przez dwa filtry. Przez jeden z nich, umieszczony u dołu urządzenia, wsysane jest otaczające powietrze, które następnie zostaje wysterylizowane lampami bakteriobójczymi UV i przechodzi przez drugi filtr umieszczony u góry naprzeciwko stołu, na którym wykonuje się szczepienia. W ten sposób sam stół z ustawionymi na nim naczyniami oraz osoba szczepiąca są owiewane sterylnym powietrzem, które zabezpiecza przed ewentualną infekcją w czasie wykonywania zabiegu. W pomieszczeniu do szczepień powinien wisieć czysty fartuch, który przed pracą jałowiony jest razem z całym sprzętem.

W dniu, w którym zamierza się wykonywać szczepienie należy przetrzeć ściany oraz płytę stołu, ewentualnie stojący na stole mikroskop, alkoholem denaturowym, 0,5%-owym roztworem chloraminy T, 1%-owym roztworem HgClg ( sublimatem), sterinolem (bromek dimetylo- aurylobenzyloaminowy) lub innym środkiem dezynfekcyjnym. Następnie należy ustawić na stole potrzebne narzędzia, zapakowany w szary papier i uprzednio zdezynfekowany w suszarce plik bibuły lub szarego papieru o wymiarach 40x30 cm, służący do chłodzenia narzędzi, które po zamoczeniu w 70%-owym alkoholu (wlanym do wysokiej menzurki) i opaleniu nad palnikiem gazowym lub spirytusowym wkłada się w celu ostudzenia pomiędzy arkusze sterylnego papieru. Narzędzia po opaleniu można także kłaść na chwilę na sterylną płytkę Petriego . Po wejściu do wysteryllzowanego pomieszczenia zakłada się wiszący w nim wyjałowiony fartuch, na twarzy umocowuje się maseczkę wysterylizowaną w autoklawie, a ręce dezynfekuje 70%-owym roztworem CgHcOH. Przy szczepieniu można pracować również w wyjałowionych rękawiczkach chirurgicznych.

Naczynia z zaszczepionymi eksplantataml umieszcza się w odpowiedniej komorze lub w specjalnym pokoju wzrostowym. W Polsce można nabyć komory klimatyzacyjne produkcji NRD o nazwie Mytron z regulowaną temperaturą i wilgotnością ale bez oświetlenia, które trzeba zamontować w ramach własnych*

Bardziej racjonalny Jest pokój wzrostowy (fitotron) najczęściej urządzany w piwnicach, gdzie występują małe wahania temperatury. Niezbędne jest Jednak zainstalowanie w tym pomieszczeniu urządzeń utrzymujących właściwą temperaturę, wilgotność i wietrzenie.

W pokoju wzrostowym powinny znajdować się metalowe stelaże z półkami. Ponad każdą półką montuje się zestaw świetlówek, których liczba decyduje o natężeniu światła. Naczynia szklane mogą stać wprost na półkach albo mogą być umieszczane w specjalnych metalowych stojakach obciągniętych (lub nie) folią. Naczynia na stojakach umieszcza się nieco skośnie, aby powierzchnia znajdującego się w nich agaru mogła być jak największa.

W pokoju wzrostowym można także ustawić rotor lub wytrząsarki, które przez stały ruch powodują napowietrzanie pożywki w umieszczonych na nich naczyniach z wyszczepionymi (lub zaszczepionymi) eksplantatami.
 
Ostatnia edycja:

sub

Guest
Pożywki

Pożywki stosowane w kulturach in vitro różnią się pomiędzy sobą ilością i jakością składników mineralnych oraz zawartością witamin i innych dodatków, w zależności od gatunku rośliny, typu tkanki lub organu, do kultury którego są przeznaczone. Podstawą każdej pożywki są makro- i mikroelementy (tab. 6).

Makroelementy

Makroelementy spełniają ważną rolę w metabolizmie komórek jako składniki budulcowe (azot, fosfor, wapń, żelazo) oraz jako czynniki regulujące koloidalno-chemiczne właściwości cytoplazmy (potas i wapń). Zmiana stężenia składników w pożywce może wywołać różne zachowanie się izolowanych tkanek.

Azot dodawany Jest do pożywek w postaci nieorganicznej, Jako sole amonowe i azotanowe, a także w postaci organicznej, jako aminokwasy, peptony, białka itp. Zamiast pojedynczych aminokwasów stosuje się na ogół ich zestawy w postaci hydrolizatu kazeiny lub produkowanego w Polsce preparatu o nazwie Peptobak-Bacutil.

Fosfor wchodzi w skład pożywek w postaci Jednowartościowego lub dwuwartościowego Jonu fosforanowego.

Potas i s ó d stosuje się w postaci azotanów, chlorków i fosforanów* Potas ma ogromne znaczenia w procesach związanych z syntezą materiałów budulcowych, zwiększa odporność m choroby i nie sprzyjające warunki zewnętrzne*

Siarka dostarczana jest do pożywki w postaci utlenionej, Jako jon SO4", i w tej formie Jest przez rośliny pobierana Siarka wchodzi także w skład białek aminokwasów i witamin.

Magnez dodawany jest do pożywek w postaci siarczanu magnezu. Pobieranie tego składnika zależy od odczynu i od stężenia innych Jonów w pożywce. Magnez ma zdolność tworzenia wiązań chałatowych* Nadmierne ilości potasu w pożywce zmniejszają przyswajalność magnezu.

Wapń pobierany jest w postaci Jonu Ca2+. W skład pożywek wchodzi w powiązaniach z chlorem i azotanem. Przy braku wapnia, nawet małe ilości manganu, miedzi i żelaza działają toksycznie. Obecność wapnia zwiększa odporność roślin na nie sprzyjające warunki klimatyczne.

Żelazo dawniej dodawane było w postaci jedno- i dwuwartościowego jonu. Ostatnio stosuje się żelazo w formie chelatu, najczęściej Jako Fe-EDTA (w połączeniu z kwasem etyleno – diaminotetra octowym - kwas wersenowy) lub NaFe-EDTA (sól sodowo-żelazowa połączona z kwasem wersenowym). W tej formie żelazo jest łatwiej przyswajane przez rośliny.

Mikroelementy

Mikroelementy, Jak bor, mangan, molibden, cynk, miedź oraz ultramikroelementy, Jak kobalt. Jod i glin biorą udział w procesach katalitycznych Jako grupy proatetyczne enzymów.

Bor- Jako źródło tego pierwiastka stosuje się do pożywek kwas borowy. Zbyt wysokie pH pożywki obniża dostępność boru.

Mangan pobierany Jest w postaci Jonu dwuwartościowego Mn2*, a do pożywek stosuje się w formie siarczanu manganowego.

Molibden dodaje się do pożywek w postaci utlenionej MoO, jako sól sodowa* Przyswajalność molibdenu zwiększa się w środowisku zasadowym.

Cynk stosuje się w postaci siarczanu cynku (Zn ) Przy braku cynku ulega zahamowaniu powstawanie tryptofanu, tj. aminokwasu niezbędnego do syntezy auksyn.

Miedź Jest pobierana w postaci jonu dwuwartościowego Cu (siarczan miedzi) lub w postaci związków chałatowych. Odczyn zasadowy pożywki zmniejsza przyswajalność miedzi nieorganicznej.

Kobalt określany jako ultramikroelement jest dodawany do pożywek w postaci chlorku kobaltu.

Jod (ultramikroelement) stosuje się do pożywek w formie jodku potasu.

Glin (ultramikroelement) jest stosowany w niewielkich ilościach w postaci chlorku glinu.

Węglowodany

Dla roślin w kulturach in vitro duże znaczenie mają substancje organiczne, a zwłaszcza węglowodany. Związki te są podstawowym źródłem energii oraz elementami strukturalnymi, z których roślina tworzy większość innych związków organicznych wchodzących w skład komórki. Rośliny wyższe są autotrofami, tzn. mogą syntetyzować w procesie fotosyntezy związki organiczne z dwutlenku węgla, wody i związków mineralnych przy udziale energii świetlnej. Izolowane natomiast, mikroskopijne części roślin, są zdolne utrzymać się przy życiu w kulturach in vitro tylko wówczas, gdy w pożywce znajdzie się cukier będący źródłem węgla i energii. Do pożywek najczęściej dodaje się sacharozę w ilości od 18 do 30 g/l. Podniesienie zawartości sacharozy do 60 g/l wywołuje np. u fragmentów cebul lilii intensywny wzrost kalusa bez objawów organogenezy, podczas gdy eksplantaty trzymane przez cały czas na pożywce z normalną koncentracją sacharozy tworzyły kalus, na którym po 6-8 tygodniach ukazywały się najpierw korzenie, a później liście. Po zainicjowaniu kalusa w normalnej pożywce 1 przeniesieniu go na pożywkę z wysoką zawartością sacharozy dało się zauważyć powstawanie korzeni i cebul bez tworzenia liści.

W niektórych przypadkach bardziej przydatne dla kultur tkankowych okazują się glukoza lub fruktoza. Dla roślin z rodziny Graminae (Poaoeae) dodaje się do pożywki sorbitolu (d-gluoitol), który występuje w komórkach tych roślin. Sorbitol jest także składnikiem mleczka kokosowego, stosowanego często jako dodatek do pożywek.

Występujący w roślinach inozytol ( mioinozytol, mezoinozytol) Jest alkoholową pochodną cukrów prostych i także wchodzi w skład pożywek. Jako strukturalny składnik błon komórkowych Jest przydatny dla kultur in vitro .

Witaminy

Do wzrostu i rozwoju izolowanych tkanek potrzebne są również witaminy, a mianowicie:


  • T i a m i n a (witamina B-, aneuryna) stosowana Jest w pożywkach w postaci chlorowodorku aneuryny w stężeniu 0,1-1,O mg/l pożywki.
  • Pirydoksynę( witamina Bg, adernina) stosuje się w postaci chlorowodorku pirydoksyny w stężeniu 0,01-1,0 mg/l pożywki.
  • Biotyna(z grupy witamin B, dawniej zwana witaminą H) stosowana Jest w stężeniu 0,01-1,0 mg/l pożywki.
  • Kwas pantotenowy (z grupy witamin B) Jest używany w postaci pantotenianu wapnia w stężeniu 0,1-1,0 mg/l pożywki.
  • Kwas nikotynowy ( witamina PP, niacyna) do pożywek stosuje się w formie kwasu w stężeniu 0,5-1,0 mg/l.
  • Kwas oC-askorbinowy (witamina C) w pożywkach Jest stosowany w stężeniu 1-100 mg/l.
  • Kwas p-aminobenzoesowy stosuje się rzadko, w stężeniu 0,05-1f0 mg/l pożywki.
  • Kwas foliowy (witamina B) używany również rzadko, w stężeniu 0,01-0,1 mg/l pożywki.


Regulatory wzrostu

Regulatory wzrostu (syntetyczne substancje wzrostowe) są to związki organiczne, które w małych ilościach wykluczających oddziaływanie troficzne stymulują, hamują lub w inny sposób wpływają na procesy wzrostu i rozwoju rośliny. Do regulatorów wzrostu zalicza się auksyny, cytokininy oraz gibereliny.

Na zamierzony kierunek wzrostu i rozwoju eksplantatów w kulturach in vitro wywiera wpływ zarówno wzajemna proporcja pomiędzy auksynami i cytokininami, Jak również warunki zewnętrzne { światło i temperatura).

Auksyny powstają w merysternach wierzchołkowych pędu i korzeni i przez system przewodzący kierowane są do innych części,w których wywołują wydłużanie komórek i organów, stymulują regenerację brakujących organów, np. powstawanie korzeni, inicjowanie pąków przybyszowych, natomiast w kulturach in vitro powodują namnażanie kalusa, który bez auksyn nie może rosnąć*

Do auksyn należą:

Kwas 3-indolilooctowy (IAA, IES) - Jedyna auksyna występująca w tkankach roślinnych naturalnie. Do pożywek stosuje się w stężeniu 0,01-10,0 mg/l pożywki.

Kwas alfa-naftylooctowy (NAAj NES) - auksyna syntetyczna, stosowana w stężeniu 0,001-10,0 mg/l pożywki.

Sól potasowa kwasu alfa-naftylooctowego (KNA) - auksyna syntetyczna, stosowana w stężeniu 0,1-0,3 mg/l pożywki.

Kwas 3-indolilomasłowy (IBA> IBS) - auksyna syntetyczna, stosowana w stężeniu 0,001-10,0 mg/l pożywki.

Kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy ( 2,4-D) - auksyna syntetyczna, stosowana w stężeniu 0,001-10,0 mg/l pożywki.

Cytokininy powstają głównie w korzeniach. Związki te indukują podziały i różnicowanie się komórek. Mogą one stymulować powrót komórek miękiszowych do stanu tkanki merystematycznej, a więc wywołują proces odmładzania tkanek. Ostatnio wykazano, że cytokininy w przeciwieństwie do auksyn sprzyjają wybijaniu pędów bocznych w kulturach in vitro. Cytokininy współdziałają z auksyna- mi i innymi regulatorami wzrostu. Gdy zawartość cytokininy w pożywce jest większa niż auksyny tkanka wytwarza pąki, natomiast nie tworzą się wtedy korzenie. Przy zachowaniu przeciwnych proporcji następuje rozwój systemu korzeniowego, a organogeneza zostaje zahamowana .

Do naturalnych cytokinin należą: zeatyna 6-(4-hydroksy-3-me- tylobutylo-2-enylo) aminopuryna oraz 6-izopentynyloaminopuryna (IPA).

Syntetyczne substancje o działaniu podobnym do cytokinin noszą nazwę kinin. Do najlepiej poznanych należą: kinetyna( 6-furfurylo- aminopuryna* FAP) i 6-benzyloaminopuryna( BAP, BA-benzyloadenina) oraz 6-benzyloamino-9-(2)-tetrahydropyranylpuryna(PBA). Kinetyna dodawana do pożywek znacznie poprawia wzrost merystemów, jak również skraca okres od izolacji stożka wzrostu do wysadzania roślin.

Do pożywek dodaje się czasami adeninę ( zasada azotowa o budowie purynowej, wchodząca w skład nukleotydów). Jej działanie jest podobne do cytokinin; w obecności kinetyny wpływa na tworzeniesię pąków przybyszowych. Do kultur in vitro cytokininy stosuje się w stężeniu 0,1-40 mg/l pożywki.

Gibereliny występują przede wszystkim w szybko rosnących i rozwijających się organach roślinnych, natomiast całkowicie wyrośnięte organy takie, jak liście, łodygi czy też korzenie mają niewielkie ilości tych związków. W jednej roślinie może znajdować się kilka giberelin (poznanych jest ponad 50 różnych gibere- lin), które stymulują wydłużanie i podziały komórek.

Analogicznie do auksyn pobudzają wzrost kambium oraz wpływają na wzrost pąka szczytowego. Istnieje pogląd, że ich działanie polega na likwidowaniu czynników hamujących wzrost, zatem przerywają spoczynek i przyspieszają kwitnienie. Nie stymulują wzrostu korzeni i nie wpływają na powstawanie kalusa.

W kulturach in vitro stosuje się niekiedy kwas giberelowy (GA, który wywołuje intensywny wzrost i rozwój tkanek.

Zamiast chemicznie czystych regulatorów wzrostu, do pożywek dodaje się niekiedy substancji pochodzenia naturalnego,w ilościach nie przekraczających 10% objętości pożywki. Są to: hydrolizat kazeiny, mleczko kokosowe (płynna endosperma) zawierające duże ilości substancji wzrostowych i witamin, ekstrakt drożdżowy, miąższ bananów, sok ananasów, sok z owoców cytrusowych i pomidorów lub też, zbierany wiosną, sok z topoli,lub sok z krzewu winorośli.

Agar jest polisacharydem złożonym głównie z galaktozy. Do pożywek dodaje się agar-agar w ilości 5-10 g/l roztworu. W laboratoriach światowych spotyka się dobrze oczyszczone, sproszkowane i wzbogacone w mikroelementy preparaty agarowe o nazwie Difco-Bac- to-Agar, Noble-Agar, Purified-Agar lub Agar No 1-Code L 11, Agar No 3-Code L 13 i inne.

Węgiel aktywowany działa aseptycznie, do pożywek dodaje się w ilości 20 g/l pożywki.

Odczyn pożywek

Ważnym czynnikiem wpływającym na prawidłowy wzrost i rozwój eksplantatów jest optymalny odczyn pożywki. Dla merystemów storczyków i złocieni powinien on wynosić 5,7-5,8 pH, dla pelargonii 5,6-5,8 pH, dla goździków szklarniowych 5,5-6,5 pH. Kwasowość pożywki dla większości roślin wynosi 5,5-6,0 pH. Wartość pH należy ustalić po dodaniu agaru, a przed zabiegiem sterylizacji. Sterylizacja i dodatek agaru na ogół obniżają odczyn pożywki o 0,5 pH.

W trakcie trwania kultury obniża się także odczyn pożywki, chociaż szybkość zmian zależy od ilości pożywki w naczyniu wzrostowym. Przy niskim pH wynoszącym 4,5 agar staje się płynny.

Stan fizyczny pożywek

W zależności od rodzaju rośliny, od użytego organu, czy też od stadium rozwojowego eksplantatu, te same pożywki mogą być używane w dwóch formach: stałej i płynnej. Celem otrzymania pożywki stałej zestala się ją agarem ( stopień zestalenia zależy od ilości użytego agaru), Jak również żelem poliakrylamidowym.

Na pożywkach płynnych dobrze rosną protokormy cymbldium, pojedyncze komórki lub wyizolowane zarodki. Eksplantaty zanurza się w pożywce lub umieszcza na mostkach z bibuły filtracyjnej sporządzonych w kształcie litery M lub odwróconego V. Na mostkach można stymulować wzrost merystemów katleji, próbowano także prowadzić merystemy goździków, złocieni i azalii.

Dobre rezultaty uzyskuje się na ogół zarówno na pożywce stałej, jak i płynnej. Przy stosowaniu pożywki stałej niekorzystnym objawem jest to, że rozwijające się korzenie rosną częściowo w górę, co utrudnia późniejsze wysadzanie roślin. W płynnej pożywce natomiast brak jest wielu substancji zawartych w agarze, które stymulują na ogół wzrost izolowanych tkanek.

W celu wytworzenia kalusa wielu roślin i protokormów u storczyków ( specyficzna tkanka wyrastająca przy kiełkowaniu nasion storczyków i przy kulturach merystemów) merystemy umieszcza się najpierw na pożywce agarowej, a po zainicjowaniu kalusa należy przenieść tkankę na pożywkę płynną w celu jej namnożenia. Kierunek dalszego wzrostu zależy od pożywki. 0 ile namnożony kalus czy protokormy podzieli się i umieści na nowej pożywce płynnej, będą mnożyły się dalej, jeśli zaś zostaną przeniesione na pożywkę stałą wystąpi organogeneza i tworzenie się pędów bocznych.

Eksplantaty zanurzone w kulturach płynnych wymagają stałego napowietrzania pożywki. Dopływ powietrza znosi biegunowość tkanek, hamuje wzrost pędów, przyspiesza natomiast rozwój kalusa, protokormów lub namnażanie komórek. Znanych jest kilka sposobów napowietrzą ni. 3 pożywek płynnych- Jeden z nich polega na umieszczeniu naczyń w aparatach rotacyjnych* tzw. rotorach* Tarcza aparatu sporządzona z pleksiglssu. ustawiona pionowo, poziomo lub ukośnie pod kątem 30-45 oto że obracać się z prędkością 1-200 obrotów na minutę. Na rotorach szybkoobrotowych wzrost tkanki Jest na ogół szybszy.

Zamiast umieszczania probówek w rotorach można zastosować jeszcze inne urządzenia* Do cylindrów szklanych o wymiarach 5x60 cm lub kolb o pojemności 1l stosowanych jako naczynia wzrostowe i podłączonych do pompy wodnej wprowadza się od dołu prze filtrowane powietrze. Przechodzące przez pożywkę pęcherzyki powietrza wywołują ciągły ruch roztworu i umieszczonych w nim eksplantatów. W zależności od inwencji pracowników, urządzenia wstrząsające mogą być różnego, typu.

Namnażanie kalusa lub protokormów można przeprowadzać w kolumnie szklanej napełnionej do 1/3 wysokości wysterylizowaną pożywką płynną z umieszczonymi w niej w sterylnych warunkach eksplantatami. Do napowietrzania takiego aparatu stosuje się pompę akwariową tłokową, z której powietrze po przejściu przez filtr ( węgiel aktywny) wchodzi dołem do kolumny szklanej zamkniętej od góry korkiem z waty. Wielkość wpływającego strumienia powietrza musi być niewielka ma ono tylko powodować łagodny i równy ruch pożywki nie zwiększając ciśnienia w kolbie, które powodowałoby wypchnięcie korka z waty, izolującego całość od niesterylnego powietrza z otoczenia.

Innym urządzeniem jest mieszadło elektromagnetyczne. Materiał roślinny w roztworze pożywki umieszcza się w zlewce, do której wrzuca się magnes w postaci małej, płaskiej sztabki żelaznej zatopionej w rurce ze szkła pyreksowego. Pod płytką, na której u- mieszczone jest naczynie (zlewka), znajduje się ruchomy elektromagnes. Wskutek uruchomienia elektromagnesu powstaje wirujące pole elektromagnetyczne* Pole to obraca magnes znajdujący się na dnie naczynia, w rezultacie czego następuje mieszanie roztworu i dokładne obmywanie materiału roślinnego*

Sporządzanie pożywek

W celu usprawnienia pracy i uniknięcia odważania poszczególnych składników, do każdej sporządzanej pożywki przygotowuje się co pewien czas roztwory macierzyste, które można przechowywać przez długi okres w lodówce w temperaturze

Roztwory regulatorów wzrostu przetrzymuje się w zamrażalniku nawet przez rok. Składniki pożywki łączy się z grupami, aby uniknąć wytrącania się pierwiastków.

Przygotowuje się więc osobno stężone roztwory makroelementów i mikroelementów, natomiast wszystkie inne składniki przygotowuje się raczej osobno. Roztwory mogą być stężone 10-, 100- lub 1000-krotnie.

Roztwory macierzyste witamin, pojedynczych aminokwasów i fito- hormonów sporządza się w ten sposób, aby w 1 ml roztworu znajdowało się 0,1 mg danego związku.

Roztwór żelaza wymaga starannego przygotowania. NaFe-EDTA wykonuje się w następującej kolejności: na wadze analitycznej odważa się 5,57 g FeSO^ 7H20 i 7,45 g Na2EDTA, następnie wsypuje do kolby miarowej o pojemności 1 1 i uzupełnia wodą destylowaną do kreski.

Roztwór Fe-EDTA sporządza się w następujący sposób: 26,1 g kwasu etylenodiaminotetraoctowego ( wersenowego) rozpuścić w 268 ml roztworu KOH o stężeniu 1 mol/l, dodać 24,9 g FeSO4 7 H2O i dopełnić wodą do 1l. W celu utlenienia żelaza należy przez roztwór przepuszczać powietrze w ciągu kilku godzin. Tak otrzymane roztwory są kompleksowymi związkami żelaza, związkami macierzystymi, z których w miarę potrzeby pobiera się tylko kilka ml, w zależności od rodzaju pożywki. Roztwór żelaza powinien być przechowywany w lodówce. Żelazo dodaje się w formie chelatu Fe-EDTA, ponieważ w postaci zwykłych nieorganicznych soli trudno rozpuszcza się w roztworze pożywki przy pH powyżej 5. Kationy takiej soli reagują z grupą OH wytrącając osad Fe203 3H2O.

Regulatory wzrostu przed użyciem do pożywek należy rozpuścić,


  • Auksyny -10 mg substancji rozpuszcza się w kilku kroplach roztworu KOH o stężeniu 1 mol/l i uzupełnia wodą destylowaną do 100 ml.
  • Cytokininy -10 mg substancji rozpuszcza się w kilku kroplach roztworu HC1 o stężeniu 1 mol/l i uzupełnia wodą destylowaną do 100 ml.
  • Kinetyna rozpuszcza się bardzo trudno. Różni autorzy podają różne rozpuszczalniki, a więc może to być zarówno roztwór HC1 o stężeniu 1 mol/l stosowany w ilości kilkunastu kropel, 50%- -owy roztwór etanolu, dimetylosiarczan lub 2%-owy roztwór NaOH.
  • Gibereliny: GA3 rozpuszcza się w wodzie destylowanej po podgrzaniu, chociaż należy pamiętać, że związek ten pod wpływem wysokich temperatur ulega inaktywacji.


Po przygotowaniu roztworów macierzystych sporządzenie 1 litra pożywki polega na tym, aby do około 500-700 ml wody bidestylowanej dodać kolejno odmierzone ilości makro- i mikroelementów, witamin, regulatorów wzrostu, aminokwasów i cukru. Agar dodaje się na końcu.

0 ile używa się agaru produkcji krajowej mającego postać włókien, należy odważoną ilość, co najmniej dzień wcześniej, pokruszyć i namoczyć w wodzie destylowanej, którą trzeba kilka razy zmienić. Po wrzuceniu do pożywki wypłukanego agaru, pożywkę uzupełnia się wodą destylowaną do 1000 ml i podgrzewa aby rozpuścić agar. Z kolei przystępuje się do ustalenia odczynu pożywki używając do tego celu roztworów NaOH lub HC1 o stężeniu 1 mol/l. Kwasowość ustala się najdokładniej na pH-metrze. Po wykonaniu pożywki rozlewa się ją do naczyń wzrostowych: probówek, kolbek lub słoików w ilości 1/3 lub 1/4 objętości naczynia.

Używając węgla aktywowanego wsypuje się go do naczyń przed rozlaniem pożywki, również i mostki z bibuły umieszcza się w pustych jeszcze probówkach.

Naczynia zamyka się po rozlaniu pożywki odpowiednimi korkami. 0 ile używa się korków z waty i gazy można je dodatkowo zabezpieczyć przed infekcją zakładając kapturki z folii aluminiowej. Korki z pianki poliuretanowej stosowane do zamykania probówek trzeba najpierw umyć w gorącej wodzie z dodatkiem niewielkiej ilości detergentu, następnie kilkakrotnie przepłukać w wodzie zwykłej i destylowanej. Suszyć w suszarce w temperaturze 105 C przez 2,5-3 godzin.


P1100508.jpg



Sterylizacja naczyń, pożywek i narzędzi

W kulturach in vitro bardzo ważnym zabiegiem jest jałowienie sprzętu i stosowanych pożywek. Sterylizację naczyń przeprowadza się metodami fizycznymi, poddając naczynia szklane działaniu suchego, gorącego powietrza lub nasyconej pary wodnej. W tym celu szkło ogrzewa się w suszarce w temperaturze 180 C przez 1/2 godziny, w temperaturze 160°C przez 2 godziny lub w temperaturze 105°C przez 4-5 godzin. Można także sterylizować naczynia w autoklawie w temperaturze 110-121°C w czasie 15-20 minut.

Naczynia szklane silnie zanieczyszczone należy umyć najpierw w ciepłej wodzie z dodatkiem detergentów, a następnie chromianką (KgCrO4 * H2SO4), która ma silne właściwości utleniające. Zamiast chromianki można użyć wodorotlenku sodu lub sody krystalicznej. Następnie należy 6-krotnie wypłukać wodą bieżącą, 2 razy wodą destylowaną i wysuszyć w suszarce w temperaturze 105 C przez 2 godziny. Narzędzia metalowe służące do wycinania eksplantatów i przenoszenia ich na pożywki, tj. igły preparacyjne, skalpele, pensety, maski chirurgiczne do osłony nosa i ust, płytki Petriego należy przed szczepieniem zapakować w papier i wysterylizować w autoklawie w takich samych warunkach jak pożywkę, tzn. zachowując ciśnienie 100 kPa, temperaturę 121°C, czas 30 minut. Po jałowieniu należy je dokładnie wysuszyć. Pożywki po rozlaniu do naczyń uprawowych sterylizuje się zazwyczaj termicznie w autoklawie w temperaturze 110-121°C pod ciśnieniem 50-100 kPa przez 15-30 minut.

Pełną sterylizację uzyskuje się jednak stosując zabieg, zwany tyndalizacją, przeprowadzany w aparacie Kocha. Polega on na 2-3-krot- nym ogrzewaniu jałowionej pożywki bieżącą parą wodną do temperatury 90-100°C w odstępach 24-godzinnych. Ogrzewanie wstępne ma na celu zniszczenie wegetatywnych form drobnoustrojów, a ogrzewania drugie i trzecie powodują zniszczenie mikroorganizmów, które w temperaturze 25°C wykiełkowały z przetrwalników w przerwach między zabiegami.

Tyndalizację stosuje się dla pożywek zawierających substancje rozkładające się w wysokich temperaturach, np. giberelinę, która w temperaturze powyżej 90°C ulega inaktywacji. Również cukry sterylizowane w zbyt wysokich temperaturach ulegają karmelizacji.

Pożywki zawierające dodatki organiczne, takie jak mleczko kokosowe, odkaża się przez filtrowanie używając specjalnych sączków z ziemi okrzemkowej, szkła spiekanego lub estrów celulozy.

Czas odkażania termicznego zależy od wielkości naczynia, do którego rozlana została pożywka. Probówki z pożywką jałowi się przez 15 minut w temperaturze 121°C, a 20 minut w temperaturze 115°C. Kolby z zawartością 100-500 ml pożywki sterylizuje się przez 30 minut w temperaturze 121°C, a 45 minut w temperaturze 115°C. Kolby, w których znajduje się 500-5000 ml pożywki autoklawuje się przez 35-40 minut w temperaturze 121°C, a przez 50 minut w temperaturze 115°C.


Przegląd kultur in vitro

Do kultur in vitro pobierać można komórki, tkanki i organy. Kultury komórek obejmują:


  • - pojedyncze komórki wyizolowane z różnych organów roślinnych,
  • - zawiesinę komórek,
  • - protoplasty,
  • - zarodki,
  • - ziarna pyłku i pylniki.


Kultury tkankowe obejmują:


  • - merystemy lub wierzchołki wzrostu kultywowane w celu otrzymania roślin wolnych od patogenów oraz w celu zwiększenia współczynnika rozmnażania wegetatywnego ( klonalnego),
  • - kalus,
  • - protokormy.


Kultury organów obejmują:


  • - pąki wierzchołkowe i boczne oraz odcinki pędów,
  • - liście,
  • - kwiatostany i szypułki kwiatowe
  • - narządy przetrwalnikowe, a więc części łusek spichrzowych cebul, fragmenty bulw i kłączy,
  • - korzenie.


Kultury komórek

Kultury pojedynczych komórek. Kultury te prowadzą do otrzymania jednorodnych agregatów służących do badania struktury komórek, przebiegających w nich procesów życiowych, takich jak wzrost, różnicowanie i metabolizm.

Metody uzyskiwania tkanki z pojedynczych komórek są trudne i wymagają doskonałego opanowania techniki pracy oraz rodzaju pożywki i warunków wzrostu. Istnieją cztery różne metody prowadzenia tych kultur: i) na kawałku bibuły filtracyjnej, 2) w wiążącej kropli, 3) w mikrokamerze, 4) na płytkach Petriego w warstwie agaru. Pojedyncze komórki otrzymuje aię z kultury zawiesinowej przez filtrowanie lub przez pobieranie mikropipetą i pod binokularem.

Kultury zawiesinowe. Z kultur kalusa wyodrębnić można kultury zawiesinowe komórek. W zawiesinie komórki mogą występować w postaci pojedynczych, rozproszonych jednostek lub w postaci mniej lub bardziej złożonych agregatów. Kultura zawiesinowa komórek służy do badania procesów wzrostu i różnicowania oraz pozwala niekiedy uzyskać i prześledzić zjawisko organogenezy. Kultury zawiesinowe prowadzi się jako statyczne i ciągłe*

Kultury protoplastów. Wolne protoplasty uzyskuje się głównie z komórek miękiszowych liści lub z komórek kalusa. Protoplasty pochodzące z komórek miękiszowych liści mają jednolitą budowę genetyczną, natomiast otrzymane z kalusa mogą różnić się stopniem poliploi- dalności ze względu na łatwość występowania mutacji w tkance kalusa hodowanej in vitro.

Kultury protoplastów, a zwłaszcza zabieg ich izolowania, a następnie hodowla protoplastów są bardzo trudne i możliwe tylko w wysoce wyspecjalizowanych laboratoriach. Jednakże kultury protoplastów okazały się nieodzowne do badań w dziedzinie fizjologii, biochemii oraz inżynierii genetycznej roślin. Szerokie zastosowanie dla kultur protoplastów przewiduje się również w hodowli roślin. Połączenie dwóch protoplastów pochodzących z komórek somatycznych wybranych roślin matecznych może doprowadzić do powstania nowych, cennych mieszańców w ramach jednego gatunku lub międzygatunkowych, a nawet międzyrodzajowych. Aby uzyskać pozytywny efekt hybrydyzacji somatycznej i doprowadzić do powstania mieszańca należy sprawnie przeprowadzić zabieg izolacji i następnie stworzyć takie warunki, aby po połączeniu się protoplastów nastąpiło zlanie się jąder i regeneracja ściany komórkowej. Dalej na skutek następujących po sobie podziałów może powstać z tej komórki jednolita tkanka, którą można zmusić do organogenezy.

Pierwotna metoda uwalniania protoplastów polegała na wymywaniu ich z uszkodzonych tkanek będących w stanie plazmolizy. W nowej metodzie wolne protoplasty uzyskuje się doprowadzając, pod wpływem działania enzymów, do rozpuszczenia błon komórkowych lekko splazmolizowanych komórek. Wolne protoplasty przemywa się i umieszcza w płytkach Petriego na cienkiej warstwie pożywki stałej lub płynnej. Protoplasty znajdują również dobre warunki w kropli wiszącej lub w mikrokamerze*

Na zabieg izolacji protoplastów istotny wpływ ma stan fizjologiczny i zdrowotny materiału wyjściowego. Czasami także należy na wstępie poddać tkanki lub komórki działaniu różnych czynników chemicznych i fizycznych. Zaraz po uwolnieniu protoplasty są bardzo wrażliwe na światło, które hamuje ich wzrost i na zmiany stanu osmotycznego pożywki, występujące na skutek Jej przesychania.

Kultury i krzyżowanie protoplastów w warunkach in vitro stwarzają wielkie możliwości, chociaż w chwili obecnej stan prac w tej dziedzinie wiedzy jest jeszcze w stanie początkowym.

Kultury zarodków. Kultury zarodków służą do badań teoretycznych oraz mają znaczenie praktyczne. Kultury izolowanych zarodków służą do badań nad przebiegiem procesów wzrostu i rozwoju, wpływem zawartości endogennych regulatorów wzrostu, działaniem* światła i temperatury oraz wpływem innych czynników, np. substancji mutagennych na zarodek.

W praktyce ogrodniczej dzięki zastosowaniu kultury in vitro udało się utrzymać przy życiu zarodki powstałe w wyniku krzyżowania systematycznie odległych gatunków, które w warunkach naturalnych często nie mogą się rozwijać, na skutek hamującego działania inhibitorów wzrostu znajdujących się w nasieniu. Kultury zarodków mogą także znacznie przyspieszyć produkcję roślin, których nasiona przechodzą po zbiorze długi okres clojrzewania. Zabieg izolowania nie jest trudny. Uzyskane zarodki umieszcza się na pożywce w położeniu bazypetalnym (inne położenie sprzyja powstawaniu kalusa).

Kultury pylników i ziaren pyłku. Kultury pylników i ziaren pyłku prowadzą do powstawania roślin haploidalnych. Z haploidów zaś przez podwojenie liczby chromosomów, np. na skutek działania kolchicyny i innych czynników mutagennych, powstają homozygoty, niezbędne w pracach hodowlanych. W sposób naturalny haploidy pojawiają się rzadko i są na ogół niedostrzegalne bez specyficznych badań.

Jednakże pomimo niewątpliwych korzyści, jakie mogą dostarczać kultury in vitro pylników i ziaren pyłku, niewiele rodzajów i gatunków roślin tworzy w tych warunkach prazarodki, z których wyrastają zdolne do życia i dalszych podziałów zarodki. Najlepsze wyniki w kulturach pylników i ziarnach pyłku uzyskuje się pobierając materiał pochodzący z kwiatów rozwijających się na początku kwitnienia. Ponadto pylnlki nie powinny być uszkodzone podczas pobierania, gdyż mają wówczas tendencję do tworzenia kalusa z komórek somatycznych woreczka pyłkowego. Ziarna pyłku mają większą zdolność do tworzenia zarodków niż pylniki, ale wymagają pożywek bardziej specyficznych, bogatych w składniki pokarmowe i substancje wzrostowe.

Kultury tkankowe

Kultury merystemów. Tego rodzaju kultury są stosowane tak w celu otrzymania roślin wolnych od patogenów, jak i zwiększenia współczynnika rozmnażania. Merystemy (tkanka twórcza) można izolować z wierzchołka wzrostu pędu głównego, pędów bocznych, z wybijających „oczek" bulw, z pąków lub wzgórków merystematycznych znajdujących się w katach liści względnie łusek spichrzowych cebul. Wielkość izolowanych merystemów jest różna. Od wielkości merystemów zależy szybkość wzrostu, a przy odwirusowywaniu także liczba roślin uwolnionych od patogenów. Panuje przekonanie, że w zależności od gatunku roślin* należy pobierać albo same merystemy, albo stożki wzrostu o długości 1-2 mm, z 1 lub 2 zawiązkami liści. Rośliny, z których izoluje się eksplantaty powinny być w fazie intensywnego wzrostu.

W kulturach tkankowych goździków szklarniowych, w celu uwolnienia od patogenów, pobiera się merystemy mniejsze od 0,5 mm, jeśli jednak rośliny są zdrowe, a kultura jest prowadzona tylko w celu rozmnażania roślin, stożki wzrostu mogą być większe - do 2 mm.

Przy rozmnażaniu złocieni pobiera się merystemy o długości 0*5 mm, u begonii ogrodowej długość merystemów powinna wynosić 0,3-1 mm. W celu od wirus owania lilii wykorzystuje się stożki wzrostu powstałe u podstawy łusek cebul, których długość wynosi 2 mm.

Za pomocą merystemów można mnożyć in vitro również storczyki. Storczyki o wzroście sympodialnym tworzą zazwyczaj pseudobulwy, które powstają z przekształcenia się łodygi. Przykładem rośliny o wzroście sympodialnym Jest cymbidium. Pseudobulwy cymbidiua są otoczone skrętolegle liśćmi, których pochwy ściśle przywierają do pseudobulwy. W kątach liści znajdują się pąki śpiące, z których w umiejętny sposób można „wyłuskać" błyszczącą grudkę merystemu. Uzyskanie merystemu ze stożka wzrostu starej, wyrośniętej pseudobulwy jest niemożliwe, gdyż Jego aktywność w tej fazie wzrostu zanika, a wierzchołek pseudobulwy drewnieje. Czynne merystemy wierzchołkowe znaleźć można tylko w młodych, wybijających pąkach wyrastających u podstawy starej pseudobulwy.

Merystemy Cymbidium powinny mieć długość około 0,1 mm. W celu szybkiego rozmnożenia innego gatunku lub odmiany storczyka wycina się merystemy o długości 0,3-1 mm lub stożki wzrostu wraz z 2-4 zawiązkami liści o długości 2-3 mm. Izolaty z zawiązkami liści rosną szybciej i są żywotniejsze.

U katlejki pąki przybyszowe znajdują się nie na pseudobulwie, która jest gładka, pozbawiona węzłów, ale na poziomo wyrastającym kłączu. Pąki, a właściwie tylko wierzchołki merystematyczne schowane są pod łuskami, z których jedna, mięsista ściśle przylega do merystemu. Izoluje się cały pączek śpiący razem z mięsistą łuską. Eksplantaty mają zazwyczaj długość około 5 mm i szerokość 2-4 mm. Po przeniesieniu na pożywkę rosną one bardzo wolno, gdyż zraniona tkanka często brunatnieje na skutek oksydacji fenoli.

U rodzaju Vanda (storczyk o wzroście monopodialnym) izoluje się merystemy z pąków wierzchołkowych lub z kątów liści, gdzie znajdują się wzgórki merystematyczne, z których w normalnych warunkach powstają pędy kwiatostanowe. Merystemy te umieszczone na odpowiednich pożywkach tworzą pędy wegetatywne.

Materiał rośliny przed pobraniem merystemu musi być starannie wyjałowiony. Pomieszczenie do szczepień wymaga dokładnego wymycia, a następnie powinno być odkażane przez 2-4 godziny za pomocą lamp bakteriobójczych UV. Stół z laminarnym przepływem powietrza, przy którym odbywa się szczepienie, musi być również wymyty i odkażony. Na stole należy ustawić wszystkie potrzebne narzędzia, naczynia z pożywką, kolbę z 7096-owym roztworem alkoholu do opalania narzędzi, pakiet sterylnego papieru do chłodzenia narzędzi, zlewki, bidestylowaną, wyjałowioną wodę oraz płytki Petriego, palnik gazowy* wyjałowione maseczki i fartuch.

Przed wejściem do pomieszczenia wyłącza się lampy UV, natomiast na 15 minut przed rozpoczęciem pracy włącza się stół z laminarnym przepływem Jałowego powietrza, który działa przez cały czas szczepienia. Merystemy izoluje się pod mikroskopem stereoskopowym lub przy użyciu lupy zegarmistrzowskiej. Igłą preparacyjną lub ostrym lancetem chirurgicznym odsuwa się liście, lub łuski i wycina merystem przez cztery cięcia wokół wzgórka, a następnie podcina od dołu. Po wycięciu eksplantat umieszcza się w naczyniu hodowlanym z pożywką i przenosi do pokoju hodowlanego lub specjalnych kamer klimatyzacyjnych*

Kultury kalusa. Kalus czyli tkanka przyranna składa się z {dezorganizowanych, stale dzielących się komórek* Tkanka ta w warunkach im vitro powstaje prawie z każdego wycinka tkanek lub organów roślinnych, ale w każdym przypadku wymaga doboru odpowiedniej pożywki. Skład pożywki wpływa nie tylko na sam proces powstawania kalusa, ale również w zależności od stopnia zestalenia pożywki lub różnej zawartości auksyn i cytokinin kalus może przybierać różną postać i zabarwienie.

W celu zachowania ciągłego wzrostu tkanki kalus owej w warunkach in vitro konieczne jest stałe jego przeszczepianie na nową pożywkę, gdyż namnażająca się tkanka zużywa zawarte w pożywce składniki pokarmowe, a jednocześnie powoduje nagromadzanie metabolitów, powstałych w wyniku przemiany materii komórek. Przy pierwszym przeszczepianiu przenosi się kalus wraz z macierzystym fragmentem rośliny, z którego powstał, zabezpieczając się w ten sposób przed ewentualnym zamieraniem komórek na skutek zranienia. W miarę jednak silnego rozrastania - bujania tkanki - podział staje się konieczny i chociaż początkowo część przeszczepów zamiera, z czasem jednak na skutek selekcji i wyboru najżywotniejszych fragmentów, liczba zamierających eksplantatów zmniejsza się lub ustaje całkowicie, o ile pożywka i warunki kultury znajdują się na optymalnym poziomie.


Kalus rosnący w kulturach in vitro wykazuje niekiedy zdolności do somatycznej (bez zapłodnienia) embriogenezy, tj. do tworzenia z komórek wegetatywnych prazarodków lub też zarodków zdolnych do organogenezy (tj. do regeneracji poszczególnych organów, a z czasem całych roślin). Zjawisko regeneracji całych roślin z komórek kalusa jest wykorzystywane do rozmnażania wielu roślin ozdobnych, takich Jak: anturium, lilie, frezje, mieczyki i inne z rodziny Liliaceae Iridaceae i Amaryllidaceae.

Pomimo wielu pozytywnych rezultatów, ścisłe określenie stałych, ogólnych zasad indukcji organogenezy w tkankach kalusowych, niezależnie od gatunku rośliny, jest jeszcze niemożliwe na obecnym etapie badań. Nie tylko bowiem skład pożywki i warunki zewnętrzne odgrywają decydującą rolę w powstawaniu tego procesu, ale również istotne znaczenie mają właściwości genetyczne roślin oraz pochodzenie, wiek i dojrzałość kalusa.

Niekiedy zdarza się, że w kalusie następuje zmiana poliploidalności komórek, wywołana działaniem różnych substancji wzrostowych zawartych w pożywce. Zmiana liczby chromosomów w komórkach kalusa może mieć w praktyce znaczenie negatywne lub pozytywne, w zależności od wartości uzyskanych mutantów.

Kultury protokormów lub ciał protokormopodobnych. Kultury te dotyczą tylko storczyków (rys. 28). Wyżej wymieniona tkanka składająca się z małych, kulistych grup komórek powstaje przy kiełkowaniu nasion wszystkich storczyków. Protokormy są początkowo blade, a dopiero po osiągnięciu długości 1-3 mm zabarwiaja się na zielono, następnie tworzą ryzoidy, później zaś w wyniku organogenezy wyrastają pędy z liśćmi i korzeniami. Merystematyczne tkanki Cymbidium sp. i innych storczyków o wzroście sympodialnym (wzrost kontynuowany Jest przez pączki boczne, a nie szczytowy) nie tworzą bezpośrednio pędu lub kalusa, Jak w przypadku innyoh roślin wyższych, lecz tkankę morfologicznie podobną do protokormu nasion storczyków. Badania fizjologiczne dowiodły, że tkanki te są identyczne.

Eksplantaty storczyków o wzroście monopodlalnym ( kontynuowanym przez pączek wierzchołkowy), Jak Cypripedium sp., Paphiopedilum sp., Phalaenopeie sp. i Iranda sp. wykształcają w warunkach in vitro słabo zróżnicowaną grudką komórek, nazwaną ciałem protokormopodobna, gdyż nie przeprowadzono dotąd badań, które wykazałyby, że są to tkanki identyczne z protokormem powstałym przy kiełkowaniu nasion. Protokormy lub ciała protokoormopodobne mają duże zdolności regeneracyjne {rys. 29). Dzięki temu narosłą tkankę nożna dzielić intensywnie w różny sposób. Można wykonywać cięcia w płaszczyźnie pionowej i poziomej, można też przecinać ją lub tylko nacinać, a następnie podzielone kawałki tkanki przenosić na nową pożywkę.

Namnażanie się protokormów i ciał protokormopodobnych. storczyków przebiega na pożywkach płynnych, w naczyniach umieszczonych na rotorze lub na innych urządzeniach wywołujących ruch pożywki.

Kultury organów

Pąki wierzchołkowe lub wycinki węzłów z pąkiem bocznym

Organy te są stosowane do rozmnażania złocieni, gerber hortensji i goździków. Przy użyciu wymienionych organów tworzenie się licznych pędów bocznych może odbywa się na drodze tzw. mikrorozmnażania oraz indukowania wieloroślinek.

Przy mikrorozmnażaniu powstający z pąka pęd dzieli się na odcinki z których każdy zawiera jeden węzeł z pąkiem bocznym. O ile potrzeba, podział może być prowadzony w kilku kolejno po sobie następujących pokoleniach.

Powstawanie wieloroślinek np. u złocieni, polega na tym, iż wszczepiony na pożywkę, zawierającą dużo kinetyny pąk wierzchołkowy regeneruje wytwarzając liczne pędy bez korzeni, gęsto skupione obok siebie (rys. 30). Rozdzielone pędy umieszczone na pożywce zawierającej dużo auksyn, w warunkach silnego oświetlenia (10 000 lx) i w temperaturze 27 C, tworzą korzenie i stają się normalnymi sadzonkami.

Odcinki łodyg do rozmnażania w warunkach in vitro pobierać można z pędów lilii, frezji i kosańców holenderskich.


normal_3443.jpg



Kultury liści.

Wiele roślin rozmnaża się in vitro za pomocą całych liści, fragmentów blaszki liściowej lub ogonka liściowego. Zazwyczaj eksplantaty tworzą najpierw kalus, ale stosując odpowiednie pożywki można wywołać powstawanie pędów lub organów przetrwalnikowych.

Niejednokrotnie za pomocą odcinków liści starano się rozmnażać begonię zimową. W ciągu 2 tygodni hodowli wzrost kontynuowały nerwy, po czym na końcach nerwów powstawał kalus, i dopiero po 5 tygodniach powstawały pędy. Stwierdzono, że najbardziej żywotne eksplantaty pochodziły z roślin matecznych, które uprawiane były w temperaturze 18-20 C przy 14-godzinnym oświetleniu. Sposoby rozmnażania begonii z ogonków liściowych okazały się również udane. Odcinki o długości 5 mm po przeniesieniu na pożywkę tworzyły najpierw kalus i korzenie, a dopiero po 3-4 tygodniach ukazywały się rośliny o wysokości 1 cm.

Fragmenty liści i ogonków liściowych anturium w kulturach in vitro zawsze tworzą kalus. Ni tkance kalus owej powstałej z wycinki liści powstawały po miesiącu inkubacji pędy, natomiast kalus wyrosły 2 ogonków liściowych nie wykazywał zjawiska organogenezy. Nowsze badania nad hodowlą in vitro anturium doprowadziły, dzięki zmianom w składzie pożywki, do ominięcia fazy tworzenia się kalusa. Organogeneza zachodzi bezpośrednio na wycinkach blaszki liściowej tych roślin.

Prowadzono również próby hodowli in vitro nerwów liściowych gerbery oraz fragmentów liści frezji, petunii, sępolii i roślin z rodziny Brom9lio.coM oraz Crassulaceae .

Kultury kwiatostanów.

Kultury te służą również do rozmnażania wielu roślin ozdobnych. W rozwijającym się kwiatostanie występuje kilka ośrodków merystematycznych, które przy zastosowaniu odpowiedniej pożywki mogą zamiast różnych organów generatywnych tworzyć pędy.

Do rozmnażania gerbery in vitro można użyć osadnik koszyczka. Do tego celu pobiera się kwiatostany w pełni wykształcone, które mają rozwinięte 2-3 okółki kwiatów rurkowatych. Z koszyczka, usuwa się wszystkie kwiaty języczkowate i rurkowate i po sterylizacji osadnik odcina się od szypułki, dzieli na 4 części i skraca do 1/3 listki okrywy koszyczka. Otrzymane odcinki umieszcza się w naczyniu wzrostowym poziomo, tak aby listki okrywy wystawały ponad pożywkę.

Eksplantaty rosną przez 4 tygodnie w ciemności w temperaturze 25°C, a następnie wynosi się je na światło. W tych warunkach, ca odpowiednio dobranej pożywce, tworzą się liczne pędy bez korzeni, które w celu ukorzenienia należy przenieść na pożywkę o innym składzie.

Do rozmnażania roślin w kulturach in vitro wykorzystać można także szypułki kwiatostanowe.

Wierzchołki szypułek kwiatostanowych złocieni po przepołowieniu umieszcza się powierzchnią cięcia na pożywce. Po tO dniach tworzą się pędy, a po dalszych 10 dniach można je oddzielać i ukorzeniać.

Próby wywołania wzrostu in vitro podstawy pędów nierozwiniętych kwiatostanów anturium nie powiodły się. Chociaż powstawała tkanka kalus owa, Jednak nie można było wywołać w niej organogenezy.

Pozytywne rezultaty otrzymano prowadząc w kulturach in vitro śpiące pączki boczne, znajdujące się na pędach kwiatostanowych u storczyków z rodzaju Phalaenopeis sp. ( storczyk o wzroście mono- podialnym, kontynuujący wzrost dzięki aktywności pąka wierzchołkowego). Po przekwitnieniu 1-szego kwiatu w kwiatostanie (groniastym) odcinek pędu pozbawiony kwiatów dzieli się na 2-3 części,tak aby każda z nich zawierała jeden węzeł z widocznym merystemem. Merystemy tworzą najpierw grupy niezróżnicowanych komórek, zwane ciałami protokormopodobnymi, a następnie w wyniku organogenezy powstają pędy. Z merystemów pobranych z dolnej części szypułki tworzą się pędy wegetatywne, a z górnej części pędy generatywne.

Kultury fragmentów cebul, bulw i kłączy.

Kultury te wykazują w warunkach in vitro duże zdolności regeneracyjne i często wykorzystywane są do szybkiego rozmnażania takich roślin, jak; hiacynty, frezje, mieczyki, amarylisy, lilie i cyklameny. Jako eksplantaty służą kawałki jednej łuski, fragmenty dwóch łusek łącznie z pączkiem przybyszowym osadzonym na piętce, wycinki bulw, kłączy lub milimetrowe odcinki pędu łącznie z kawałkiem piętki. Kierunek morfogenezy wymienionych organów zależy od zastosowanej pożywki. Duże ilości auksyn powodują tworzenie cebul przybyszowych lub kalusa, z którego dopiero po dodaniu cytokinin wyrastają pędy. Rośliny powstałe z kalusa nie zawsze są podobne do roślin matecznych, stabilność genetyczną zachowuje tylko kalus lilii i frezji.

Kultury korzeni.

Kultury te służą jedynie do badań teoretycznych dotyczących właściwości fizjologicznych, wymagań pokarmowych i morfogenezy.
 
Ostatnia edycja:

sub

Guest
Sterylizacja materiału roślinnego

Zabieg odkażania materiału roślinnego, z którego pobiera się wybrane komórki, tkanki lub organy musi być przeprowadzany bardzo starannie, gdyż w dużej mierze od niego zależy czy zaszczepiony eksplantat będzie się rozwijał, czy też Już po kilku dniach ulegnie likwidacji i całą pracę przygotowawczą: sporządzanie pożywek, jałowienie i szczepienie należy przeprowadzić od nowa. Środki stosowane do Jałowienia muszą być tak dobrane, aby niszcząc skutecznie patogeny nie ograniczały wzrostu lub nie uszkadzały izolowanego eksplantatu. Do jałowienia materiału roślinnego przydatne okazały się nastepującde preparaty i związki chemiczne.

Roztwór podchlorynu wapnia Ca(OCl)2 lub podchloryn sodu ( NaOCl). Ten ostatni związek jest składnikiem bielinki lub chlorku bielącego, który używany jest w gospodarstwie domowym* Podchloryn stosuje się w stężeniu 1–7% przez 15-30 minut, w zależności od tkanki, którą się sterylizuje.

Chloramina T używana jest w stężeniu 3%-6% przez 15-30 minut.

8-hydroksychinolina stosowana jest w stężeniu 0,5-1% przez 10-15 minut.

Sublimat HgCl2 używany jest w stężeniu 0,1-0,5%-owym przez 1-12 minut.

Woda bromowa jest to brom rozpuszczony w wod2ie w ilości 35 g/l. W ro2tworze 1 –2% bywa stosowana przez 3-15 minut.

Woda utleniona jest używana w stężeniu 10-12% przez 3-5 minut.

Alkohol etylowy jest stosowany w stężeniu 70% przez 1-5 sekund.

Ponadto do wstępnej sterylizacji roślin silnie zakażonych użyć można gotowych środków ochrony roślin, jak: Benlate - stosowany w stężeniu 0,05-0,1% przez 5-10 minut, Ceresan -w stężeniu 0,1%-owym używany przez 7-10 minut oraz Kaptan zawiesinowy w stężeniu 0,1-0,2% przez 5-10 min.

Sterylizację materiału roślinnego można podzielić na trzy fazy.

W pierwszej fazie należy wymyć roślinę pod bieżącą wodą, aby spłukać kurz lub resztki ziemi. Następnie trzeba usunąć wszelkie części utrudniające dostęp do tkanki, a więc liście, pochwy liściowe, łuski, włoski itp. Tak ogołoconą część rośliny należy wypłukać wstępnie w 0,5%-owym roztworze szarego mydła lub zanurzyć na kilka sekund w 70%-owym roztworze alkoholu, w celu odtłuszczenia 1 odpowietrzenia powierzchni. Po tych zabiegach wstępnych od całego organu odcina się mniejsze kawałki tkanki otaczające pobierany wycinek i te części poddaje się dalszej sterylizacji (rys. 31).

W drugiej fazie przeprowadza się właściwe jałowienie. Fragmenty tkanki zanurza się w odpowiednim środku chemicznym, do którego dodaje się w niewielkich Ilościach jednego z tzw zwilżaczy, zmniejszajacych zapięcie powierzchniowe zwiększajacych tym samym przy ilość środka odkażającego. Do znanych zwilżaczy należy Tween .20 stosowany w roztworze 0,05%-owym, następnie Citowett stosowany w stężeniu 0,05%-owym, SanfijLowit w .stężeniu 0,01 -05%- lub płynów używanych do prania lub mycia naczyń, np. Ludwik. Czynność tę wykonuje się w sterylnym pomieszczaniu lub na stole z laminarnym przepływem powietrza.

W trzeciej fazie następuje płukanie pobranych wycinków. Do płukania używa się wyjałowionej wody destylowanej, którą należy trzy-krotnie zmienić od czasu szczepienia pozostawia się fragmenty tkanek w wyjałowionej wodzie, W zależności od użytego materiału roślinnego, sterylizacja może ulegać różnym zmianom.

Izolowanie zalążków lub zarodków wymaga specjalnych zabiegów. Zalążnię po dezynfekcji, a przed otwarciem, zanurza się w 96% roztworze alkoholu, a następnie opala nad płomieniem. Przez wydobycie zarodków, nasiona powinny być napęczniane: sterylizację przeprowadza się przed lub po przeprowadzeniu moczenia nasion.

w kulturach in vitro poważnym utrudnieniem jest, zdarzają się niekiedy, brunatnienie tkanki na skutek oksydacji fenoli. Zjawisko to występuje przy szczepieniu pączków katleji i tkanek anturium. Środkiem hamującym proces oksydacji jest stosowana do płukania wycinków L-cysteina używana w stężeniu 1-1096-owym,

Warunki zewnętrzne w okresie prowadzenia kultur in vitro

Wzrost tkanek w kulturach in vitro zależy w znacznym stopniu od warunków zewnętrznych. Wymagania temperaturowe większości eksplantatów roślin ozdobnych mieszczą się w granicach 18-28°C przy czym stosowane są na ogół temperatury stałe, jednakowe w dzień i w nocy,

W kulturach in vitro goździków szklarniowych stosowana jest temperatura 18-20 €, ale dobre rezultaty uzyskuje się także w temperaturze 2f>-28°C, Według wskazań wielu badaczy, temperatury zalecane dla tkanek cymbidium powinny wynosić 22-26°C, natomiast optymalna temperatura dla kultur tkankowych begonii zimowej wynosi 21 °C, bowiem w temperaturze 25°C następuje zahamowanie wzrostu. Niekiedy są korzystne dzienne lub okresowe zmiany temperatury. W fazie świetlnej stosuje się wówczas temperatury wyższe, w nocy niższe. Przykładem może być pelargonia rabatowa i bluszczolistna. Kulturę tkanek tych roślin prowadzi się w ciągu dnia (16 godzin) w temperaturze 24°C, a w nocy 18°C.

Dla eksplantatów cymbidium przy utrzymywaniu 20-godzinnego dnia i światła na poziomie 5000 lx korzystnie wpływa w dzień temperatura 24 C, a w nocy 20 C. Konieczność stosowania okresowych zmian temperatury daje się zauważyć w przypadku wycinków łusek roślin cebulowych. Regeneracja cebulek przebiega najlepiej w temperaturze 12-15°C. Następnie rośliny muszą przejść okres niskich temperatur, jak to ma miejsce w warunkach naturalnych, po których następuje dalszy wzrost i rozwój.

Drugim czynnikiem ważnym dla kultury tkanek w warunkach in vitro Jest światło. U wielu gatunków roślin kultury tkanek kalusa, pylników i zarodków można prowadzić w ciemności, W celu wykształcenia kalusa i pąków przybyszowych u anturium należy umieścić eksplantaty tej rośliny w ciemności, w temperaturze 25°C. Wyrastanie liści natomiast i tworzenie się chlorofilu następuje dopiero po przeniesieniu do światła. Tworzenie się kalusa i korzeni u begonii zimowej przebiega w ciemności , a różnicowanie pędów rozpoczyna się po wystawieniu na światło.

Zapotrzebowanie na światło jest jednak indywidualną cechą izolowanej tkanki, trudno Jest więc sformułować twierdzenie ogólne. Całkowite zaciemnienie eksplantatów goździków przez 8-14 dni, a złocieni przez 7 dni sprzyja tworzeniu pędów bocznych i korzeni. Powstawanie pąków i korzeni na fragmentach bulw cyklamena następowało również w ciemności w temperaturze 24°C. Natomiast pąki kwiatowe frezji, które przetrzymywane były przez pierwsze 8 tygodni w ciemności, rozpoczęły tworzenie pąków przybyszowych i korzeni dopiero po zastosowaniu doświetlania przez całą dobę.

Natężenie światła powinno być także zróżnicowane w zależności od fazy wzrostu i gatunku rośliny. Kulturom zarodków i protoplastów wystarcza oświetlenie 500-1000 lx, do indukcji i namnażania się protokormów storczyków wystarcza światło o natężeniu 1500-3000 lx. Podobnego natężenia światła wymagają do wzrostu tkanek i orga- nogenezy lilie, asparagusy i begonie, ale np. kultury fragmentów bulw cyklamenów potrzebują światła o natężeniu 10 000 lx.

Do normalnego wzrostu izolowanych tkanek, Jak wykazują liczne prace badawcze, po zainicjowaniu kalusa, w celu zapoczątkowania organogenezy i do dalszego wzrostu pędów konieczne jest oświetlenie 12-16-godzinne. Do doświetlania kultur tkankowych powinny być stosowane lampy emitujące światło barwy niebieskiej, które wpływa na inicjowanie organogenezy, lub światło czerwone, które sprzyja ukorzenianiu. Wymagania te spełniają lampy fluorescencyjne - tzw. świetlówki, następnie lampy sodowe i lampy rtęciowe typu LRFR o mocy 250 W lub 400 W. Równomierny rozkład natężenia światła na do świetlanej powierzchni uzyskuje się przy instalowaniu lamp jarzeniowych o małych mocach, rozmieszczonych gęsto, na wysokości co najmniej 55-60 cm nad roślinami.

Lampy rtęciowe, chociaż emitują światło bogate w promienie ultrafioletowe, dla celów ogrodniczych zbudowane są ze szkła, które pochłania większość promieni ultrafioletowych - szkodliwych dla roślin. Ponadto lampy te emitują także dość znaczną ilość promieni podczerwonych zbytnio nagrzewających rośliny. Dlatego też lampy te powinny być zawieszone wyżej niż lampy jarzeniowe.

Dalsza uprawa roślin pochodzących z kultur tkankowych

Rośliny pochodzące z kultur in vitro należy wyjąć z naczyń wzrostowych po wykształceniu pędów i korzeni i przenieść do podłoża stałego. Jest to bardzo duży „szok" dla wydelikaconej rośliny, dlatego też należy Ją do tego przygotować. Przede wszystkim wskazane jest wystawienie naczyń z roślinami na światło dzienne do szklarni. Po kilku lub kilkunastu dniach zdejmuje się wieczka osłaniające naczynia i pozostawia otwarte w celu zahartowania roślin.

Innym sposobem przyzwyczajenia roślin do normalnej wegetacji jest napełnianie w warunkach sterylnych słoików typu „twist" o pojemności 1 1 wyjałowionym podłożem do wysokości 1/3 i wysadzeniu do nich roślin wyjętych z naczyń szklanych. Gdy rośliny dorosną do górnej powierzchni słoika, zdejmuje się na kilka dni wieczko, po czym wysadza się je z bryła ziemi do normalnych naczyń uprawowych. Wyjmowanie roślin z naczyń należy wykonywać bardzo ostrożnie, aby nie oderwać od pędu kruchych korzeni, zagłębionych w pożywce. Następnie należy usunąć pożywkę agarową przemywając korzenie wodą. Tak przygotowane rośliny wysadza się do podłoża stałego. Skład podłoża stosowanego do wysadzania młodych roślin jest bardzo różny. V każdym laboratorium czy też gospodarstwie stosuje się wypróbowane na miejscu podłoże. Dla storczyków może to być polystyrol, odpady gąbki i perlit zmieszane w stosunku 1:1, lub sam mech torfowiec. Dla złocieni stosuje się mieszankę złożoną w równych częściach z ziemi liściowej, torfu wysokiego i perlitu. Dla goździków szklarniowych używa się podłoża złożonego z samego torfu wysokiego zmieszanego z perlitem w stosunku 1:1. Gerberę wysadza się do torfu wysokiego, doprowadzonego do pH 4,8, z dodatkiem Flory w ilości 0,5 g/1 1 substratu. Wspólną cechą ww. podłoży powinna być całkowita sterylność, którą uzyskuje się przez dezynfekcję termiczną. Podłoże musi być lekkie i przepuszczalne.

Rośliny pochodzące z kultur in vitro wysadza się do małych doniczek typu Jiffy-pot, do skrzynek, misek, doniczek ceramicznych lub plastykowych.

Rośliny zaraz po wysadzeniu są niezwykle wrażliwe ca suszę panującą w powietrzu. Powinny być często opryskiwane, tj. zamgławiane drobnym rozpyłem wody. Dobre rezultaty uzyskuje się ustawiając ponad małymi roślinami tunele foliowe o wysokości 50-60 cm, dzięki którym powietrze wokół roślin jest stale wilgotne. Jednakże zamgławianie roślin spełni swoją rolę tylko wówczas, gdy temperatura w szklarni utrzymywana będzie na poziomie 20-24°C z niewielkim 2-3°C spadkiem w nocy.

Po ukorzenieniu roślin w nowym podłożu można przystąpić do ich nawożenia. Stosuje się dolistne dokarmianie roślin 0,1%-owym roztworem Florovitu jeden raz na tydzień lub podlewanie roztworami nawozów wieloskładnikowych o niskim stężeniu. Cymbidia pochodzące z rozmnażania z merystemów kwitną po 3-4 latach, goździki rozpoczynają kwitnienie po 2-3 latach, złocienie i gerbery po 1-1,5 roku.



Chronologiczne zestawienie badań nad kulturami in vitro

Historia badań nad kulturami in vitro sięga 1839 r., kiedy to Schwann i Schleiden wysunęli teorię totipotencji komórek roślinnych. Podstawowe zasady dotyczące metody hodowli izolowanych organów i tkanek roślinnych w kulturach in vitro opracował i wprowadził do badań naukowych Haberlandt w 1902 r., chociaż prowadzone przez niego prace nie dawały pozytywnych wyników. Dopiero w kilka lat później, opierając się na wskazaniach Haberlandta, dotyczących roślin, udało się Harrisonowi, Burrowsowi i Carrel owi utrzymać przy życiu w warunkach in vitro niektóre tkanki ludzkie i zwierzęce. Sukcesem także uwieńczone zostały doświadczenia Knudsona, który w 1922 r. opracował asymbiotyczną metodę generatywnego rozmnażania storczyków, doprowadzając do kiełkowania nasion bez udziału grzybów symbiotycznych.

W latach dwudziestych XX w. Robblns i Kotte niezależnie od siebie zapoczątkowali, Jednakże z różnym powodzeniem, kulturę in vitro wierzchołków korzeni storczyków i pąków różnych roślin* Wiele udanych doświadczeń nad prowadzeniem organów i tkanek roślinnych w kulturach in vitro przeprowadził White, który w 1934 r. jako pierwszy utrzymał przy życiu i doprowadził do wzrostu korzenie pomidora, stosując do pożywki glukozę i wyciąg z drożdży. Nie udało mu się jednak wywołać zjawiska organogenezy w rosnących tkankach. Dopiero odkrycie przez Wenta i Thimanna w latach 1935-1937 obecności w tkankach roślinnych auksyny - kwasu indolilo-3-octowego - IAA ( zwanej dawniej heteroauksyną), a także wykazanie iż wpływa on na procesy rozwojowe roślin, otworzyło nowe możliwości prowadzenia kultur in vitro.

I tak w latach 1937-1939 White oraz Gautheret i Nobćcourt wprowadzając do pożywek IAA uzyskali ciągły, bujny wżrost tkanki kalusa, a z czasem doprowadzili do powstania korzeni z tkanki spichrzowej marchwi.

Odkrycie wpływu auksyny na wzrost i podział komórek wywołało wzmożony rozwój badaii nad warunkami wzrostu organów, tkanek i komórek roślinnych w kulturach in vitrvf powstała bowiem możliwość rozmnażania roślin tą metodą. Najbardziej twórczy okres tej gałęzi wiedzy rozpoczął się w latach czterdziestych XX w. Próby wzrostu zarodków w kulturach in vitro rozpoczął w 1902 r. Hanning, następnie w 1929 r* Laibach prowadził kulturę zarodków lnu. W 1941 r. Van Overbeek (i inni) stosując mleczko kokosowe jako komponent pożywek, uzyskali pozytywne rezultaty przy kultywowaniu zarodków bielunia. Istotnie ważną datą w historii rozwoju badań nad kulturami in vitro Jest 1946 r., kiedy to Bali doprowadził do odtworzenia całych roślin z wierzchołków wzrostu pędów tytoniu i łubinu. W 1948 r. Skoog i Tsui, ustalając w pożywce właściwe proporcje auksyn do adeniny (pochodna cytokinin), doprowadzili do organogenezy, tj. powstania pędu i korzeni z kalusa tytoniu, a organogenezę kalusa sekwoji w 1950 r. uzyskał Bali.

Od 1949 r. wyłoniły się perspektywy praktycznego wykorzystania kultur in vitro. Limasset 1 Cornuet, którzy także pracowali nad rozmnażaniem roślin ze stożków wzrostu w kulturach in vitro zaobserwowali, iż dzięki zastosowaniu tej metody można doprowadzić do odwirusowariia roślin. Wierzchołki wzrostu dalii porażonych wirusem mozaiki okazały się wolne od tych patogenów. Możliwość odwlrusowy- wania roślin dzięki kulturom in vitro potwierdzili w 1952 r. Morel i Martin. Pracując nad różnymi, silnie zawirusowanymi, odmianami, dalii uzyskali z wyizolowanych merystemów wierzchołkowych tych roślin w kulturach in vitro osobniki potomne wolne od wirusów.

Badając procesy regeneracji tkanek w warunkach in vitro Tultcke doprowadziła w 1953 r. do powstania kalusa z ziaren pyłku miłorzą- bu. W 1954 r. Muir ( i inni) uzyskali po raz pierwszy w kulturach in vitro całą roślinę z jednej wyizolowanej komórki roślinnej.

W latach 1954-1957 wyniki prac Millera i Skooga, Okumary, Jabłońskiego i innych wniosły nowe dane do prac nad rozmnażaniem roślin w kulturach in vitro W 1954 r. Miller pracując ze Skoogiem w jego laboratorium dokonali odkrycia kinetyny i zbadali rolę tej substancji w procesach organogenezy. Kinetyna, określona jako 6-furfu- ryloaminopuryna (FAP) była odtąd w postaci chemicznie czystej stosowana w innych pracach ww. autorów. W 1957 r. Miller i Skoog badając tkankę kalusową tytoniu stwierdzili, iż w zależności od stosunku ilościowego IAA i kinetyny w pożywce można uzyskać powstawanie pędów lub też tworzenie korzeni.

W latach 1958-1959 Steward uzyskał prazarodki w kulturach zawiesinowych kalusa, a Reinert wywołał powstawanie zarodków z tkanki kalusowej marchwi.

W 1959 r. ukazał się pierwszy podręcznik o kulturach in vitro tkanek roślinnych opracowany przez Gauthereta. W 1960 r. Morel opracował powszechnie dzisiaj stosowaną metodę mnożenia storczyków z merystemów w kulturach in vitro.

Nowe możliwości wykorzystania kultur in vitro zaistniały w latach 1964-1966, kiedy to Guha i Meheswari po raz pierwszy otrzymali roślinę haploidalną z ziarna pyłku bielunia, a w 1967 r. Bourgin i Nitsch doprowadzili do powstania kalusa 1 haploldalnych zarodków zdolnych do organogenezy w kulturach in vitro pyłków tytoniu. Do 1979 r., jak podają Preil i Hunke, otrzymano osobniki haploidalne 20 rodzajów roślin stosując hodowlę in vitro pylników.

Indukcję kwitnienia w kulturaoh in vitro tkanek tytoniu zapoczątkowano w 1965 r., a w 1967 r. Pierik doprowadził do indukcji kwiatów w kalusie- miesięcznicy po przetrzymaniu roślin matecznych w niskiej temperaturze.

Próby uzyskania wolnych protoplastów prowadził Już w 1892 r. Klercker, ale po raz pierwszy izolację protoplastu z kultury zawie sinowej komórek dokonali w 1969 r. Eriksson i Jonassen, a następni w 1970 r. Cocking doniósł, iż doprowadził uwolniony z komórki protoplast do odtworzenia ściany komórkowej i do dalszych podziałów.

W 1970 r. dokonana została po raz pierwszy przez Powera i innych fuzja dwóch protoplastów, a w 1972 r. Carlson przeprowadził krzyżowanie międzygatunkowe roślin w wyniku zlania się dwóch protoplastów.
 
Ostatnia edycja:

sub

Guest
uzupełnienie

Zapomniałem... o podaniu źródła :( Tekst pochodzi z ksiażki:

Rośliny Ozdobne

Skrypt dla studentów wydziałów ogrodniczych akademii rolniczych
PWN Warszawa 1987
ISBN 83-01-06672-5


autorzy: Kazimierz Grabowski, Joanna Krause, Anna Lisiecka, Krystyna Oszkinis, Stanisław Szczepaniak.

redaktor: Mirosława Zalewska

ciekawostka : skład na maszynie do pisania przygotowała Bogumiła Łysiak [ inne czasy :>]



ps: specjalnie dla użyszkodnika herbsman - miłośnika herbaty :>


=============================================
edit
=============================================

No i tematów powiązanych nie ma :

Temat najbardziej powiązany:

https://www.forum.haszysz.com/wstep-do-domowej-hodowli-roslin-vitro-t24728.html

=============================================
 
Ostatnia edycja:

Sativex

Well-known member
Rejestracja
Lis 1, 2010
Postów
64
Buchów
0
No to dzieki sub'owi możemy sami prowadzić zapłodnienia invitro :crazy:
 

KochamDom

Well-known member
Weteran
Rejestracja
Gru 18, 2009
Postów
1,896
Buchów
0
Y. A co się stało z chłopakiem który już się w to bawił tutaj? Inny temat to był?
 

Góra Dół