S
sub
Guest
Chwilowo bez obrazków - do uzupełnienia : brak formatowania etc. Niezły tekst choć stary bardzo - obrazki wkrótce - niekoniecznie w tekście.
KULTURY IN VITRO
Określenie „kultura in vitro" odnosi się do hodowli komórek, tkanek lub fragmentów różnych organów w naczyniach szklanych, na sztucznie sporządzonych pożywkach, przy zachowaniu ściśle kontrolowanych, sterylnych warunków. Metoda ta znalazła zastosowanie w badaniach podstawowych, a także okazała się przydatna w ogrodnictwie, rolnictwie i w innych naukach stosowanych.
Badania teoretyczne oparte na kulturach in vitro prowadzą do poznania takich zagadnień, jak: totipotencja, tj. zdolność odtwarzania całej rośliny z pojedynczych komórek, procesu różnicowania i metabolizmu komórek i tkanek oraz wpływu czynników mutagennych na komórki roślinne. Metoda ta umożliwiła także poznanie wielu zagadnień opracowywanych w biologii eksperymentalnej* W praktyce kultury in vitro znalazły szerokie zastosowanie. Dzięki tej metodzie można:
- - szybko rozmnożyć wybrane, cenne rośliny mateczne lub gatunki wymierające,
- - uzyskać rośliny wolne od patogenów,
- - przyspieszyć i ułatwić prace hodowlane - przez wykrycie i rozmnożenie roślin o dużej różnorodności genetycznej wyrosłych ze zmutowanej tkanki kalusa, a także przez otrzymanie osobników homozygotycznych uzyskanych z ziaren pyłku lub komórek woreczka zalążkowego,
- - przechowywać tkanki roślinne przez długi okres
Materiał roślinny do kultur in vitro należy pobierać z roślin znajdujących się w pełni wegetacji. Większą zdolność do regeneracji wykazują także eksplantaty pobierane z młodszych partii rośliny, np. z zarodni; pobierane z dojrzałych nasion tworzą tylko kalus i korzenie, a pobierane w 14-18 dni po zapyleniu dają kalus zdolny do organogenezy.
Termin pobierania eksplantatów jest szczególnie ważny u roślin, które zapadają w stan spoczynku. Tkanki pobrane w tym okresie wymagają traktowania substancjami wzrostowymi lub powinny być wypłukane w celu usunięcia inhibitorów. Cebule roślin ozdobnych lub ich fragmenty stosowane do hodowli in vitro łatwiej jest zmusić do regeneracji pod koniec fazy chłodzenia, niż na początku tego okresu.
Rozmnażanie w kulturach in vitro
Wiele cennych gatunków i odmian roślin ozdobnych rozmnaża się wyłącznie wegetatywnie9 gdyż osobniki uzyskane z nasion nie powtarzają cech rośliny matecznej. Jednakże przy stosowaniu tradycyjnych metod wegetatywnego rozmnażania uzyskuje się ograniczoną liczbę roślin potomnych. Dlatego też możliwość masowego mnożenia roślin w kulturach in vitro stwarza nowe perspektywy dla produkcji ogrodniczej. W kulturach in vitro mogą rosnąć i rozwijać się komórki, tkanki lub fragmenty organów roślinnych. Pierwszym widocznym objawem regeneracji jest zazwyczaj powstawanie kalusa. W zależności od składu zastosowanej pożywki, kalus można intensywnie mnożyć lub można wywołać organogenezę, tj. powstanie pąków przybyszowych, które wyrastając dają normalne rośliny. Obecnie w warunkach in vitro rozmnaża się 230 gatunków roślin ozdobnych, w tym około 100 gatunków storczyków.
Zastosowanie kultur tkankowych w produkcji ogrodniczej doprowadziło do osiągnięcia mniej lub więcej wysokiego współczynnika rozmnażania wielu roślin. U goździków np. z jednego merystemu można w wyniku hodowli in vitro otrzymać aż 10 min roślin. Z 1 merystemu hortensji po 3 miesiącach uzyskuje się od 100 do 150 roślin. Aby zwiększyć współczynnik rozmnażania należy zastosować wielokrotne dzielenie i przeszczepianie pędów lub tkanki kalusa w tzw. subkulturach. Przy długotrwałej hodowli kalusa i dużym tempie wzrostu może jednak wystąpić niekorzystne zjawisko polegające na zmianie liczby chromosomów w poszczególnych komórkach. Jeżeli z komórki, która uległa mutacji, w wyniku organogenezy powstanie pęd, wyrosła z niego roślina różni się zazwyczaj od rośliny wyjściowej, przy czym zmiany mogą być pozytywne lub negatywne.
Aby uniknąć masowego namnażania kalusa, a jednocześnie zwiększyć liczbę otrzymywanych roślin w kulturach in vitro stosuje się różne sposoby mnożenia. Jednym z nich jest podział na części pędu otrzymanego bezpośrednio z izolowanego stożka wzrostu bez przejścia fazy kalusowej. Pęd dzieli się na części (sadzonki), każda obejmująca jedno międzywęźle i dalej prowadzi na pożywkach. Po kilku tygodniach ze stożka wzrostu znajdującego się w kącie liścia powstaje pęd przybyszowy, który można dalej dzielić lub przenosząc na odpowiednie pożywki wywołać inicjację korzeni. Metoda ta, zwana mikrorozmnażaniem, znalazła zastosowanie przy rozmnażaniu złocieni i goździków.
Inną metodą masowego rozmnażania roślin w kulturach in vitro jest indukowanie pędów bocznych u izolowanego stożka wzrostu. Na odpowiedniej pożywce ( np. Murashige'a i Skooga) z dużą ilością cytokininy u podstawy izolowanego wierzchołka wzrostu powstają po pewnym czasie zespoły pędów, zwane wieloroślinkami. Każdy oddzielony pęd w zależności od sposobu dalszego prowadzenia może posłużyć do otrzymania nowych wieloroślinek lub do uzyskania normalnej sadzonki, Ten sposób rozmnażania stosowany jest w przypadku goździków, złocieni i gerber.
Do roślin masowo rozmnażanych w kulturach in vitro należą obecnie storczyki. Odmiany ogrodowe storczyków są przeważnie heterozygotami, dlatego też potomstwo uzyskane z nasion jest bardzo różnorodne pod względem genotypowym nie mówiąc o tym, iż metoda generatywnego rozmnażania storczyków jest trudna i długotrwała. Spośród otrzymanych siewek wyselekcjonowanie osobników, które wyróżniają się zdrowotnością, jakością i wielkością plonu trwa 6-10 lat. U cymbidium np. z 1000 siewek wybrać można w tym czasie zaledwie 1-3 wartościowe rośliny.
Również współczynnik rozmnażania wegetatywnego storczyków w tradycyjnej uprawie jest mały. Z 1 rośliny cymbidium po 3 latach uprawy uzyskuje się zaledwie 4-6 roślin potomnych. Natomiast dzięki zastosowaniu kultur tkankowych w ciągu 1 roku z 1 merystemu cymbidium można wyprodukować co najmniej 1 milion roślin (teoretycznie nawet około 4 min), a z 1 merystemu katleji można uzyskać przeciętnie 25-100 roślin, maksymalnie 3000. Metoda merystematycznych kultur storczyków nie tylko znacznie przyspieszyła i usprawniła dotychczasową-produkcję tych roślin, ale otworzyła także nowe możliwości przeprowadzenia badań w zakresie morfologii, fizjologii i genetyki tej grupy roślin. Należy dodać, iż meryklony, tj. rośliny uzyskane na drodze rozmnażania z tkanek w kulturach in vitro kwitną znacznie szybciej niż otrzymane z nasion.
Meryklony cymbidium zakwitają po 4-6 latach, podczas gdy osobniki otrzymane z siewu dopiero po 6-10 latach. Meryklony dendrobium kwitną natomiast już po 2 latach od chwili wyizolowania merystemu.
Prowadzenie kultur tkankowych w celu rozmnażania klonalnego roślin przebiega w kilku etapach.
I etap obejmuje okres początkowy. W ciągu 10-14 dni po szczepieniu ujawniają się ewentualne porażenia. Zainfekowane kultury należy odrzucić. W warunkach sprzyjających (odpowiednia pożywka, żywotny eksplantat) po 3-4 tygodniach stają się widoczne objawy wzrostu, pojawia się grudka kalusa, protokormu (u storczyków), cebulki, zarodek lub stożek wzrostu. Po osiągnięciu odpowiedniej fazy rozwoju, tj. po 6-8 tygodniach, eksplantat przenosi się na świeżą pożywkę ( czynność tę nazywa się pasażowaniem).
-etap polega na namnażaniu tkanek lub pędów. Z chwilą gdy kultura obejmuje całą przestrzeń w naczyniu, dzieli się tkanki lub oddziela pędy i przenosi na nowe pożywki. Czynność tę powtarza się dotąd, dopóki nie osiągnie się planowanej liczby egzemplarzy (subkultury). Protokormy storczyków namnaża się w pożywkach płynnych, umieszczając naczynia szklane na różnego typu rotorach.
-etap obejmuje indukowanie organogenezy w kalusie i w proto"kormach, ukorzenianie pędów lub występowanie okresu spoczynku organów przetrwalnikowych, np. u cebul roślin ozdobnych.
-etap dotyczy przygotowania otrzymanych roślin lub gotowych organów do życia in vivo. Na wstępie kultury przenosi się do szklarni, aby rośliny przystosowały się do nowych warunków. Niekiedy rośliny wysadza się do wyjałowionego podłoża stałego, dalej jednak zachowując warunki in vitro. Na kilka dni przed wyjęciem z naczyń szklanych otwiera się korki lub wieczka słoików w celu zahartowania roślin.
Uwalnianie roślin od patogenów
Przy masowej produkcji roślin ozdobnych istnieje niebezpieczeństwo epidemicznego rozszerzania się chorób. 0 ile pasożyty grzybowe można stosunkowo łatwo zwalczyć fungicydami, to bakteriozy i wirozy są trudne do opanowania. W walce z tymi patogenami oprócz przestrzegania ścisłej higieny oraz właściwych zabiegów pielęgnacyjnych istotnym elementem jest posługiwanie się zdrowymi roślinami matecznymi i sadzonkami.
Przy uwalnianiu roślin od wirusów lub .bakterii okazało się, że najmłodsze tkanki roślinne, tj. merystemy, są z reguły wolne od patogenów i te właśnie części roślin pobiera się do kultur in vitro Powinno się izolować jak najmniejsze merystemy, gdyż pomimo słabej żywotności tylko z nich otrzymane rośliny są zdrowe i wolne od wirusów i bakterii.
Efekt odwirusowania roślin można zwiększyć stosując zabieg, zwany termoterapią. Polega on na traktowaniu roślin matecznych przez kilka tygodni temperaturą w granicach 35-39 C. W tak wysokiej temperaturze stożki wzrostu roślin rosną szybciej aniżeli trwa wzrost i rozwój patogenów, które nie nadążają zasiedlać powstającej tkanki. Pobierając merystetay z roślin matecznych poddanych działaniu wysokiej temperatury istnieje duże prawdopodobieństwo otrzymania zdrowych roślin.
Dla roślin wrażliwych zabieg termoterapii można zmodyfikować stosując przez kilka tygodni tempera tiary zmienne. Po okresie temperatur wysokich, np. 40°C, stosowanych przez 4 godziny rośliny poddaje się działaniu temperatury 16-20°C przez 20 godzin.
Teraoterapia może być stosowana także dla sadzonek, nasion, cebul, bulw itp. Organy te przed pobraniem merystemów lub wierzchołków wzrostu (wierzchołek wzrostu zawiera merystem wierzchołkowy i 2-3 zawiązki liści) zanurza się w wodzie o temperaturze 35-54°C na kilka minut lub godzin. Takie organy przetrwalnikowe, jak bulwy, cebule i inne poddawane są termoterapii po zakończeniu wzrostu, organy zielne natomiast muszą być przed tym zabiegiem zahartowane, co polega na ograniczeniu podlewania i zaprzestaniu nawożenia.
Przed użyciem do dalszego rozmnażania roślin otrzymanych w warunkach in vitro wykonuje się testy na obecność patogenów. W celu wykrycia wirusów stosuje się test biologiczny i test serologiczny. Test biologiczny polega na zakażeniu rośliny wskaźnikowej ( różne dla różnych gatunków roślin użytkowych) sokiem rośliny, która poddana była zabiegowi odwirusowania. Brak objawów chorobowych wirozy na liściach rośliny wskaźnikowej świadczy o udanym zabiegu.
Test serologiczny, w obecności. odpowiedniego antyserum, pozwala wykryć różne wirusy. Rośliny wolne od wirusów nie są na nie uodpornione, dlatego też dalsze zabiegi uprawowe powinny zmierzać do ochrony zdrowych roślin przed ponowną infekcją. Metoda odwirusowania roślin stosowana jest najczęściej dla goździków, złocieni, frezji, mieczyków, hortensji, begonii, pelargonii, lilii, kosaćców i storczyków.
Zastosowanie kultur in vitro w hodowli twórczej
Klonowanie (rozmnażanie wegetatywne) komórek, tkanek lub organów w kulturach in vitro daje pewien procent samorzutnie powstających mutacji na skutek zmian informacji genetycznej. Liczba odchyleń może wynosić 1-5096, Mutacja występująca w tkance stałej u roślin uprawianych in vivo - pozostaje na ogół nie zauważona, jeżeli Jednak ze zmutowanej komórki stałej w kulturze in vitro powstanie merystem wtórny, który ulegnie organogenezie, to z powstającego pędu może wyrosnnć roślina o zmienionych cechach.
Innym zagadnieniem jest klonowanie roślin będących chimerami lub roślin z dziedzicznie zróżnicowanymi warstwami tkanek. Przez rozdzielenie i kulturę in vitro zróżnicowanych warstw komórek, można uzyskać rośliny o nowych cechach. Zjawisko to zostało wykorzystane w pracach nad poinsecją.
W hodowli roślin ozdobnych dużą wartość mają mieszańce hetero- zyjne. Do prowadzenia tej hodowli niezbędne Jest posiadanie różniących się, lecz spokrewnionych ze sobą, możliwie czystych, homozygotycznych linii hodowlanych. Ponieważ wiele cennych, produkcyjnych odmian roślin ozdobnych jest heterozygotami, zagadnienie hodowli mieszańcowej napotyka na duże trudności. W tym układzie więc możliwość otrzymania roślin haploidalnych w kulturach in vitro jest sprawą bardzo cenną. Rośliny haploidalne uzyskać można in vitro w wyniku organogenezy w tkance kalusowej powstałej z ziaren pyłku lub haploidalnych komórek woreczka zalążkowego. Haploidalne rośliny są Jednak bardzo wrażliwe, podatne na choroby i słabo rosną. Przy użyciu kolchicyny można podwoić liczbę chromosomów uzyskując diploida o cechach horaozygoty. Prace tego rodzaju prowadzone są na gerberach.
Przy długo trwającej kulturze in vitro haploidalnego kalusa często obserwuje się występowanie mutacji spontanicznych. Spotyka się także samoistną zmianę tkanki haploidalnej w diploidalną.
Przechowywanie tkanek w kulturach in vitro
Udane próby przechowywania kultur tkankowych przeprowadzono z trawami i złocieniami. Tkanki złocieni zamknięte w żelatynowych kapsułkach i umieszczone w temperaturze 2-3 C przy wilgotności względnej powietrza 90% i oświetleniu 10-20 lx przetrwały 6 lat. Metoda ta ma przed sobą duże perspektywy. Dzięki takiemu „bankowi" tkanek można usprawnić rozmnażanie cennych roślin ozdobnych.
Wyposażenie laboratorium do kultur in vitro
Do prowadzenia laboratorium niezbędne są następujące urządzenia, aparatura, sprzęty i narzędzia:
- prąd elektryczny - 220 V i 360 V,
- woda ciepła i zimna,
- gaz i palniki,
- meble: stoły (w tym 1 laboratoryjny), szafy, szafki, stelaże z półkami,
- stół z laminarnym przepływem sterylnego powietrza (rys. 25),
- komora klimatyzacyjna,
- autoklaw,
- wytrząsarka, mieszadło elektromagnetyczne lub rotor (rys. 26) do utrzymywania w ruchu probówek z pożywką płynną,
- lodówka z zamrażalnikiem,
- destylarka,
- bidestylarka (najlepiej szklana),
- suszarka,
- mikroskop stereoskopowy,
- waga techniczna,
- waga laboratoryjna,
- piecyk do sterylizacji narzędzi,
- zmywarka do naczyń lub myjnia laboratoryjna,
- łaźnia wodna,
- pehametr,
- szkło laboratoryjne: zlewki o różnej pojemności, kolby 2-5 1 oraz kolby 50-250 ml,
- probówki (rys. 27),
- butelki, słoiki, cylindry miarowe, płytki Petriego,
- pojemniki na wodę destylowaną,
- narzędzia: pipety, skalpele, pensety, nożyczki, porcelanowa łyżka do nabierania odczynników, ezy, folia aluminiowa, wata, lignina, gaza, cienki sznurek, środki myjące, miski, wiadra, szczotki do mycia probówek, koszyczki metalowe do suszenia korków, koszyczki do probówek, szczelny pojemnik metalowy - do przechowywania wysterylizowanych narzędzi, waty, ligniny oraz masek chirurgicznych służących do zasłonięcia ust i nosa podczas szczepień.
Laboratorium zajmuje zazwyczaj "kilka pokoi. Główne pomieszczenie stanowi pożywkarnia, gdzie sporządza się pożywki, przysposabia naczynia do kultur oraz przygotowuje materiał roślinny do szczepień.
W pożywkami powinien znajdować się stół, najlepiej laboratoryjny, do którego podłączony zostanie gaz i woda. Na stole tym można zmontować urządzenie szklane do otrzymywania wody bidestylowanej, którą używa się do sporządzania pożywek* Następnie niezbędne są szafy i szafki z półkami na szkło laboratoryjne 1 inne drobne przedmioty, szafy na odczynniki chemiczne oraz lodówka, w której przechowuje się substancje wzrostowe oraz stężone roztwory pożywek.
W pożywkami powinno znaleźć się również miejsce na mały stolik, przy którym można byłoby sporządzać korki do zatykania probówek lub innych naczyń. Korki mogą być wykonane z waty lub ligniny obciągniętej gazą oraz z pianki poliuretanowej. Jako korki można używać również kapsli termoodpornych, korków z plastyku lub korków gumowych z odpowietrznikami, tj. małymi otworkami w środku korka zatkanymi watą.
W pobliżu pożywkami należy urządzić pokój wagowy. Pomieszczenie to nie może być narażone na przeciągi i wstrząsy, a więc najlepszy byłby pokój nieprzechodni. Wagi powinny być ustawione na mocnym, stabilnym stole wagowym lub na specjalnie wzmocnionych i wypoziomowanych płytach przytwierdzonych do ścian bocznych. W pomieszczeniu tym może również znajdować się pH-metr służący do ustalania odczynu sporządzanych pożywek.
Myjnia, jak sama nazwa wskazuje, służy do mycia szkła. W wyposażeniu myjni powinien znaleźć się podwójny zlew kamionkowy, półki do naczyń, suszarka do naczyń, szafki do magazynowania środków myjących oraz do kwasu siarkowego potrzebnego do sporządzania chromianki, kubły i miski. W nowocześnie wyposażonej myjni do mycia naczyń stosuje się domową zmywarkę zaadaptowaną do mycia szkła laboratoryjnego lub myjnie laboratoryjne, które można odpowiednio zaprogramować. W myjni może być umieszczony autoklaw, o ile nie ma dodatkowego pomieszczenia na to urządzenie, a także w pobliżu dopływu prądu i wody powinna znaleźć się destylarka, gdyż woda destylowana potrzebna jest do płukania naczyń, narzędzi i korków gumowych lub z tworzyw sztucznych.
Następnym, ważnym pomieszczeniem w laboratorium kultur in vitro jest pokój ( kamera) do szczepień zaopatrzony w wentylator i gaśnice. Pokój ten powinien być chociaż do połowy wysokości wykładany płytkami ceramicznymi, gdyż ułatwia to utrzymanie czystości łącznie z myciem ścian przed każdym szczepieniem. Szczepienie można wykonywać przy zwykłym stole lub przy stole z laminarnym przepływem powietrza. Do pomieszczenia tego należy przeprowadzić światło, wodę i gaz. Woda potrzebna jest do zamontowania umywalkisłużącej do mycia rąk przed szczepieniem, gaz natomiast umożliwia stosowanie palnika do opalania wlotów naczyń szklanych przed założeniem korków oraz do opalania narzędzi przy szczepieniu ( o ile nie ma w laboratorium specjalnego piecyka do dezynfekcji). Do tego celu można również użyó lampkę spirytusową, W pokoju do szczepień powinna znaleźć się przynajmniej Jedna lampa bakteriobójcza UV zawieszona u sufitu. Stół z laminarnym przepływem sterylnego powietrza produkowany w Zakładach „Polon" w Poznaniu działa na zasadzie oczyszczania powietrza przez dwa filtry. Przez jeden z nich, umieszczony u dołu urządzenia, wsysane jest otaczające powietrze, które następnie zostaje wysterylizowane lampami bakteriobójczymi UV i przechodzi przez drugi filtr umieszczony u góry naprzeciwko stołu, na którym wykonuje się szczepienia. W ten sposób sam stół z ustawionymi na nim naczyniami oraz osoba szczepiąca są owiewane sterylnym powietrzem, które zabezpiecza przed ewentualną infekcją w czasie wykonywania zabiegu. W pomieszczeniu do szczepień powinien wisieć czysty fartuch, który przed pracą jałowiony jest razem z całym sprzętem.
W dniu, w którym zamierza się wykonywać szczepienie należy przetrzeć ściany oraz płytę stołu, ewentualnie stojący na stole mikroskop, alkoholem denaturowym, 0,5%-owym roztworem chloraminy T, 1%-owym roztworem HgClg ( sublimatem), sterinolem (bromek dimetylo- aurylobenzyloaminowy) lub innym środkiem dezynfekcyjnym. Następnie należy ustawić na stole potrzebne narzędzia, zapakowany w szary papier i uprzednio zdezynfekowany w suszarce plik bibuły lub szarego papieru o wymiarach 40x30 cm, służący do chłodzenia narzędzi, które po zamoczeniu w 70%-owym alkoholu (wlanym do wysokiej menzurki) i opaleniu nad palnikiem gazowym lub spirytusowym wkłada się w celu ostudzenia pomiędzy arkusze sterylnego papieru. Narzędzia po opaleniu można także kłaść na chwilę na sterylną płytkę Petriego . Po wejściu do wysteryllzowanego pomieszczenia zakłada się wiszący w nim wyjałowiony fartuch, na twarzy umocowuje się maseczkę wysterylizowaną w autoklawie, a ręce dezynfekuje 70%-owym roztworem CgHcOH. Przy szczepieniu można pracować również w wyjałowionych rękawiczkach chirurgicznych.
Naczynia z zaszczepionymi eksplantataml umieszcza się w odpowiedniej komorze lub w specjalnym pokoju wzrostowym. W Polsce można nabyć komory klimatyzacyjne produkcji NRD o nazwie Mytron z regulowaną temperaturą i wilgotnością ale bez oświetlenia, które trzeba zamontować w ramach własnych*
Bardziej racjonalny Jest pokój wzrostowy (fitotron) najczęściej urządzany w piwnicach, gdzie występują małe wahania temperatury. Niezbędne jest Jednak zainstalowanie w tym pomieszczeniu urządzeń utrzymujących właściwą temperaturę, wilgotność i wietrzenie.
W pokoju wzrostowym powinny znajdować się metalowe stelaże z półkami. Ponad każdą półką montuje się zestaw świetlówek, których liczba decyduje o natężeniu światła. Naczynia szklane mogą stać wprost na półkach albo mogą być umieszczane w specjalnych metalowych stojakach obciągniętych (lub nie) folią. Naczynia na stojakach umieszcza się nieco skośnie, aby powierzchnia znajdującego się w nich agaru mogła być jak największa.
W pokoju wzrostowym można także ustawić rotor lub wytrząsarki, które przez stały ruch powodują napowietrzanie pożywki w umieszczonych na nich naczyniach z wyszczepionymi (lub zaszczepionymi) eksplantatami.
Ostatnia edycja: